范夢珠，郭婷，林文珍，李文瑾，陳平，洪志駿，張少輝,

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.浙江熊貓乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司，浙江溫州325800；3.浙江輝肽生命健康科技有限公司,浙江溫州325800）

0引言

蛋白質(zhì)在人們的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)組成中占據(jù)重要位置。蛋白在水解后其分子量明顯變小，隨著蛋白水解程度的增加，其抗原性明顯降低[1]。水解度是衡量蛋白水解程度最主要的因素，影響著蛋白水解產(chǎn)物的功能特性如乳化、凝膠、風(fēng)味等[2-3]。脫脂乳蛋白種類豐富，有研究表明不同蛋白種類的水解產(chǎn)物對健康人的飽腹感和抑制食欲激素的分泌會產(chǎn)生一定的影響[4]。因此，脫脂乳源蛋白水解產(chǎn)物對于代餐等功能性食品的開發(fā)有重要價值。

目前，水解蛋白的制備方法主要有酸水解法、堿水解法和酶水解法。酸水解和堿水解都有一定的弊端且不具有專一性[5]。酶水解法的主要優(yōu)勢是水解條件溫和、副反應(yīng)少、不破壞敏感氨基酸和水解產(chǎn)物，在營養(yǎng)、風(fēng)味、工藝等方面均優(yōu)于酸、堿水解法[6-7]。因酶具有專一性的特點，而脫脂乳中蛋白種類豐富，因此單純用酶對脫脂乳蛋白進(jìn)行水解并不能達(dá)到很好的效果。

乳酸菌是一類重要的益生菌，瑞士乳桿菌是乳酸菌中營養(yǎng)缺陷型最高的菌種之一，具有強大的蛋白水解能力，其蛋白水解產(chǎn)物具有抗高血壓、提高免疫力、消炎和抗癌等功能[8-11]。本文是采用瑞士乳桿菌與酶結(jié)合對乳源蛋白進(jìn)行水解的方法，以蛋白水解度為指標(biāo)，并通過響應(yīng)面法對工藝進(jìn)行優(yōu)化，為益生菌水解蛋白粉的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1材料及方法

1.1材料

MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；脫脂乳，恒天然商貿(mào)(上海)有限公司；瑞士乳桿菌CICC6024，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；復(fù)合胰蛋白酶（酶活力2×105 u/g），AB Enzymes公司；酸性蛋白酶（酶活力1×105 u/g），寧夏夏盛實業(yè)集團(tuán)有限公司；胃蛋白酶（酶活力4×105 u/g），默克生命科學(xué)（上海）有限公司；氯化鈉NaCl，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；其余試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2設(shè)備

JB-VS-1300U超凈工作臺，上海屹明凈化設(shè)備有限公司；SCIENTZ真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GI36T高壓滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；Froma 700低溫冰箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；RO 15純水系統(tǒng)，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；GL-22M高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1益生菌水解蛋白粉制備工藝

操作要點如下：（1）菌種活化，取本實驗室-80℃低溫冰箱中凍存的瑞士乳桿菌CICC6024，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中解凍10 min。將解凍后的瑞士乳桿菌接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，接種量5%（v/v），37℃靜置培養(yǎng)12 h，此為第一次活化。從活化發(fā)酵液中取活化后的菌液再次接種于MRS液體培養(yǎng)基中，接種量2%（v/v），37℃靜置培養(yǎng)8 h，此為第二次活化。取二次活化的菌液使用。（2）酶溶液制備方法[12]。分別稱取復(fù)合胰蛋白酶0.25 g、酸性蛋白酶0.5 g、胃蛋白酶0.125 g溶于10 mL滅菌RO水中，并依次通過0.45 um濾膜、0.22 um濾膜進(jìn)行過濾除菌，分別得到酶活力為5 000 u/mL的復(fù)合胰蛋白酶溶液X,酸性蛋白酶溶液Y、胃蛋白酶溶液Z，現(xiàn)配現(xiàn)用。（3）脫脂乳濃度為12%（w/w），95±1℃巴氏殺菌5～6 min，然后冰水浴快速冷卻至42℃以下，然后接種二次活化后的菌液，在接種菌液的同時按比例接種X、Y、Z，37℃恒溫培養(yǎng)箱靜止發(fā)酵一定時間得到發(fā)酵液。（4）離心參數(shù)為2 500 g、4℃、10 min。（5）真空冷凍干燥條件為溫度-68±2℃，時間48 h，真空度2 Pa。

1.3.2蛋白酶種類的篩選及水解度的測定

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%（w/w）脫脂乳用0.1 mol／L的NaOH調(diào)至p H 7.0，95℃滅菌5min，冰水浴快速冷卻后接種二次活化后的瑞士乳桿菌菌液，接種量2%（v/v）。酶制劑的添加方式參考[13]，具體如下：根據(jù)蛋白酶的活性在接種菌種的同時分別加相應(yīng)比例的X、Y、Z蛋白酶溶液，蛋白酶用量60 u/mL，37℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h，期間每隔2 h取一次樣品，進(jìn)行水解度的檢測。水解過程中用0.5 mol／L NaOH中和水解液，用PH-stat法測水解度[14]，水解后的水解液95℃滅酶5 min，水解度計算公式：

水解度DH%=(B×M b)/(α×M p×htot)*100%

式中：B-NaOH體積，mL

M b-NaOH濃度，mol/mL

α-氨基的平均解離度，酪蛋白的1/α為2.26

M p-蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g

htot-對于酪蛋白，取值為8.2 mmol/g

1.3.3單因素實驗

根據(jù)試驗結(jié)果篩選確定復(fù)合胰蛋白酶X為最佳蛋白酶后，進(jìn)行如下單因素實驗。

（1）發(fā)酵時間的單因素實驗，條件為：復(fù)合蛋白酶用量60 u/mL、發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間分別取0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h對水解度進(jìn)行測定。

（2）蛋白酶用量的單因素實驗，條件為：發(fā)酵時間12 h，發(fā)酵溫度37℃，復(fù)合胰蛋白酶用量分別取0、20、40、60、80、100、120、140、160 u/mL對水解度進(jìn)行測定。

（3）發(fā)酵溫度的單因素實驗，條件為：發(fā)酵時間12 h，復(fù)合蛋白酶用量60 u/mL、發(fā)酵溫度分別取31、34、37、40、43℃對水解度進(jìn)行測定。

1.3.4響應(yīng)面優(yōu)化實驗

以單因素實驗的結(jié)果為基礎(chǔ)，以水解度為指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken中心設(shè)計實驗原理進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，選取發(fā)酵時間、酶制劑的添加量、發(fā)酵溫度3個影響因子，分別選取3個水平，采用3因素3水平的響應(yīng)面曲面分析方法，對水解條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，確定最佳工藝參數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1蛋白酶的篩選

根據(jù)已有的研究結(jié)果，酸性蛋白酶和瑞士乳桿菌協(xié)同發(fā)酵可以顯著提高乳源性生物活性肽的產(chǎn)量[12]。復(fù)合胰蛋白酶和胃蛋白酶是酶解法降解蛋白，提高蛋白水解度常用的兩種蛋白酶[15]。因此，在菌酶協(xié)同發(fā)酵實驗中選擇這三種蛋白酶研究發(fā)酵時間與不同種類蛋白酶對乳源蛋白水解度的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1不同蛋白酶及酶解時間對蛋白水解度的影響

從結(jié)果可以看出，發(fā)酵時間在4 h以內(nèi)，胃蛋白酶、酸性蛋白酶、復(fù)合胰蛋白酶和不加酶組對蛋白水解度影響差異不大，在4 h以后復(fù)合胰蛋白酶組對蛋白的水解優(yōu)勢明顯優(yōu)于其他三組。原因可能是在發(fā)酵初期由于p H的影響，蛋白酶的活性受到抑制，加酶組和不加酶組對蛋白水解度的影響并無較大差異。在4 h后，復(fù)合胰蛋白酶的表現(xiàn)出的活性最強，在整個發(fā)酵期間對蛋白水解的效果明顯優(yōu)于另外三組，因此選擇復(fù)合胰蛋白酶用于后續(xù)試驗。

2.2單因素實驗

2.2.1發(fā)酵時間對蛋白水解度的影響

由圖1可知，發(fā)酵初期蛋白水解度基本并無較大差異，發(fā)酵時間超4 h后，蛋白水解度開始出現(xiàn)明顯增加，12～24 h之間蛋白水解度呈現(xiàn)輕微波動，在16 h處蛋白水解度達(dá)到最大值，為71.65±3.08%，統(tǒng)計分析結(jié)果表明12 h、16 h處的水解度并無顯著性差異（P＞0.05）。分析認(rèn)為，瑞士乳桿菌是高度營養(yǎng)缺陷型的乳酸菌，自身可以產(chǎn)生豐富的蛋白酶系分解底物，滿足自身的生長，從整個協(xié)同發(fā)酵過程可以看出，瑞士乳桿菌自身表現(xiàn)出強大的蛋白水解能力，外源復(fù)合胰蛋白酶起到輔助作用。發(fā)酵初期，培養(yǎng)液沒有達(dá)到瑞士乳桿菌生長的最適p H值，其生長受到抑制，對蛋白水解的程度不高，在4 h后，逐漸進(jìn)入瑞士乳桿菌的對數(shù)期，水解程度開始出現(xiàn)快速增加。達(dá)到最大值后水解度出現(xiàn)輕微波動，一方面考慮到底物營養(yǎng)被瑞士乳桿菌吸收利用后逐漸減少，一方面可能是瑞士乳桿菌的代謝產(chǎn)物積累抑制了反應(yīng)的進(jìn)行。根據(jù)實際的生產(chǎn)情況，考慮到生產(chǎn)效率，確定12 h為最佳發(fā)酵時間，此條件蛋白水解度為68.21±2.88%。

2.2.2酶的添加量對蛋白水解度的影響

由圖2可知,胰蛋白酶劑量的增加有助于蛋白水解度的提高，最佳復(fù)合胰蛋白酶用量為80 u/mL，此條件下的水解度為69.24±3.12%。當(dāng)復(fù)合胰蛋白酶用量小于80 u/mL時，蛋白水解度隨著蛋白酶用量的增加而增加；當(dāng)用量高于80 u/mL時，蛋白水解度反而出現(xiàn)輕微下降，原因可能是隨著外源蛋白酶用量增加到一定程度后，一方面出現(xiàn)了酶與底物結(jié)合位點的飽和，另一方面外源蛋白酶對瑞士乳桿菌自身產(chǎn)生的酶系產(chǎn)生一定抑制作用，影響了瑞士乳桿菌自身的生理活動，使蛋白水解度下降。

圖2胰蛋白酶用量對蛋白水解度的影響

2.2.3發(fā)酵溫度對蛋白水解度的影響

由圖3可知，發(fā)酵溫度對蛋白水解度影響較大，隨著溫度的升高，蛋白水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)溫度達(dá)到37℃，蛋白水解度最高，為71.25±2.12%，這可能是因為37℃是瑞士乳桿菌的最適生長溫度，自身產(chǎn)生蛋白酶的能力最強。隨著溫度升高，自身生長受到抑制導(dǎo)致自身產(chǎn)生的蛋白酶的量減少，加上酶的活性也受到抑制，因此水解度急劇下降。

圖3發(fā)酵溫度對蛋白水解度的影響

由單因素試驗結(jié)果可知，以脫脂乳源蛋白水解度為指標(biāo)，復(fù)合胰蛋白酶與瑞士乳桿菌協(xié)同發(fā)酵作用最佳，最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間12 h，復(fù)合胰蛋白酶用量80 u/mL，發(fā)酵溫度37℃。以此實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化蛋白水解工藝條件

2.3.1響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以發(fā)酵時間（A）、酶用量（B）、發(fā)酵溫度（C）為自變量，以蛋白水解度為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，試驗設(shè)計及結(jié)果見表1，具體分析結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果

由表2可知，此回歸方程模型顯著性檢測P＜0.0001，極顯著，表明該回歸方程模型具有統(tǒng)計學(xué)意義；失擬項P=0.2926＞0.05，差異不顯著，表明該模型可以充分解釋響應(yīng)中的變異，未知因素對試驗結(jié)果影響較小。該模型的確定系數(shù)R2=0.9771，調(diào)整系數(shù)0.9477，說明該模型能解釋94.77%響應(yīng)值的變化，試驗誤差較小，擬合度較高，可以用此模型對蛋白水解度進(jìn)行分析和預(yù)測。

表2響應(yīng)面實驗?zāi)Ｐ头讲罘治?/p>

根據(jù)回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果，其中平方項A2、C2均小于0.01，B 2小于0.05，即發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度具有極顯著的二次效應(yīng)，酶用量有顯著的二次效應(yīng)。交互項AB小于0.05，交互項AC、BC大于0.05，說明發(fā)酵時間和酶用量的交互作用顯著，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度、酶用量和發(fā)酵溫度的交互作用不顯著。

采用Design-Expert 11.1.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的回歸方程如下：

水解度Y=-376.714+22.758A+0.717B+14.282C-0.0269AB-0.108AC+0.00316BC-0.642A2-0.00299B2-0.173C2（1）

2.3.2響應(yīng)面分析與條件優(yōu)化

模型（1）的響應(yīng)面和等高線見圖4-圖6。

由圖4可知，發(fā)酵時間固定為12 h時，發(fā)酵溫度低于37℃，隨著酶用量的增加，水解度不斷增加，而當(dāng)發(fā)酵溫度高于37℃，水解度基本處在一個較為平穩(wěn)的狀態(tài)，增加酶用量對于水解度增加的效果不大。隨著發(fā)酵溫度的升高，水解度先增加后減少，當(dāng)酶用量低于80 u/mL時，水解度的最大值受到一定限制并且最大水解度到來的較遲，當(dāng)酶用量高于80 u/mL時，水解度達(dá)到最大的階段到來的較早。根據(jù)模型分析結(jié)果，發(fā)酵溫度和酶用量交互作用顯著。

由圖5可知，發(fā)酵溫度固定為37℃,水解度隨著酶用量的增加而呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當(dāng)酶用量為80 u/mL，水解度達(dá)到最大值，當(dāng)發(fā)酵時間小于12 h時，酶用量的增加使水解度增加的效果不是很明顯，當(dāng)發(fā)酵時間在12～14 h，水解度達(dá)到一個最大的階段，隨著酶用量的增加，水解度增加的幅度較小，基本處在一個較為平穩(wěn)的狀態(tài)。根據(jù)模型分析結(jié)果，發(fā)酵時間和酶用量交互作用不顯著。

圖4蛋白酶用量B和發(fā)酵溫度C的響應(yīng)面和等高線圖（A=12 h）

圖5發(fā)酵時間A和蛋白酶用量B的響應(yīng)和等高線圖（c=37℃）

圖6發(fā)酵時間A和發(fā)酵溫度C的響應(yīng)面和等高線圖（B=80 u/mL）

由圖6可知，當(dāng)復(fù)合胰蛋白酶用量固定為80 u/mL時，隨著發(fā)酵溫度的上升，水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，隨著發(fā)酵時間的延長，水解度也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)溫度低于37℃，下降趨勢明顯，當(dāng)溫度高于37℃，水解度整體維持在一個較高水平，下降幅度較小。根據(jù)模型分析結(jié)果，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的交互作用不顯著。

根據(jù)模型分析結(jié)果，發(fā)酵時間、復(fù)合胰蛋白酶用量、發(fā)酵溫度三個因素的影響作用由大到小排列順序依次為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞酶用量。通過模型優(yōu)化，得到的最佳水解度的發(fā)酵工藝參數(shù)為：發(fā)酵時間12.88 h，蛋白酶用量83.22 u/mL，發(fā)酵溫度38.89℃，此條件下理論蛋白水解度為71.44%。

為了檢驗響應(yīng)面法優(yōu)化實驗結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化過的條件進(jìn)行脫脂乳源益生菌水解蛋白的制備的重復(fù)實驗，考慮到實際情況，對工藝參數(shù)進(jìn)行微調(diào)結(jié)果為：發(fā)酵時間13 h，蛋白酶用量83 u/mL,發(fā)酵溫度39℃。最終得到的實際蛋白水解度為72.21±2.12%，相對誤差為1.07%。因此，響應(yīng)面法所得的優(yōu)化條件參數(shù)可靠，該模型具有實用價值，可以為工業(yè)化益生菌水解蛋白粉的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

3結(jié)論

本實驗采用瑞士乳桿菌與蛋白酶結(jié)合的發(fā)酵方式，以脫脂乳為原料，以水解度為指標(biāo)。通過比較不同蛋白酶與瑞士乳桿菌結(jié)合對增加脫脂乳源蛋白水解度的效果后，篩選出制備脫脂乳源水解蛋白的最佳蛋白酶為復(fù)合胰蛋白酶。

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Bohnken中心組合原理進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到了蛋白水解度與發(fā)酵時間、酶用量和發(fā)酵溫度的回歸模型。研究結(jié)果表明：發(fā)酵溫度和蛋白酶用量的交互作用對蛋白水解度的影響為顯著（P＜0.05）。確定的最佳工藝參數(shù)為：發(fā)酵時間13 h，蛋白酶用量83 u/mL,發(fā)酵溫度39℃，此條件下蛋白水解度為72.21±2.12%。與原工藝單純用瑞士乳桿菌發(fā)酵相比，水解度提高50.90%。此研究結(jié)果為工業(yè)化發(fā)酵益生菌水解蛋白粉的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和指導(dǎo)。