李金慧，趙非，劉璇，盧昊，李克峰，王旭，

（1.天津科技大學(xué)省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.天津桑尼匹克生物科技有限公司，天津300457）

0引言

唾液酸(Sialic acids,SA)作為一類天然糖類，最初是由Blix[1]將牛下頜唾液腺蛋白分離得到的，被人們廣泛的應(yīng)用于生物系統(tǒng)中，所以才被命名為唾液酸。大部分哺乳動物組織中發(fā)現(xiàn)的唾液酸主要是N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac），其在乳中所占質(zhì)量比例可達(dá)到96%左右，因此通常把Neu5Ac稱為唾液酸[2]。

2017年12月19日，唾液酸被歐盟規(guī)定為是一種新食品原料而且廣泛存在于自然界中。唾液酸的食物來源主要是母乳，母乳中的它的最主要存在形式是唾液酸低聚糖，也就是與低聚糖結(jié)合的形式[3]。母乳中唾液酸的含量為0.3～1.5 g/L，尤其在初乳中含量可以達(dá)到1 g/L[4-5]。唾液酸也存在于牛奶、奶粉和雞蛋中等[6]。研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸是一種天然的大腦營養(yǎng)素，唾液酸可通過提高大腦神經(jīng)細(xì)胞的信息傳遞速度促進(jìn)嬰兒的記憶力和智力發(fā)育，還可以提高兒童腸道吸收能力及兒童免疫力[7]，所以部分嬰幼兒配方乳粉的生產(chǎn)廠家以此為商品的宣傳點(diǎn)，將其產(chǎn)品的唾液酸含量標(biāo)示于包裝之上，一般產(chǎn)品中唾液酸的含量在100～200 mg/100g之間[8]。

為了規(guī)范以及促進(jìn)嬰幼兒奶粉產(chǎn)品的發(fā)展，需要對唾液酸標(biāo)識值進(jìn)行有效的核實(shí)，因此需要一種合適的方法對于唾液酸含量進(jìn)行定性以及定量分析。目前，對于唾液酸的定性定量分析的方法主要是比色法[9]、高效液相色譜法[10]、液相色譜-質(zhì)譜法[11-12]、薄層分析法[13]等，而最常用的方法則是高效液相色譜法。本研究采用HPLC-FLD法，可以準(zhǔn)確測定奶粉中唾液酸含量，該方法具有簡單快速，檢測準(zhǔn)確，靈敏度相對較高等特點(diǎn)。

1實(shí)驗(yàn)

1.1儀器設(shè)備

Agilent-1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；TGL-16G型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；ABL半微量電子天平，艾德姆衡器有限公司；PL-S30T型數(shù)顯超聲波清洗機(jī)，上海博科科學(xué)儀器有限公司；渦旋混勻振蕩器，Thermo Scientific。

1.2材料試劑

市售嬰兒配方奶粉；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水儀制備的超純水；鄰苯二氨鹽酸鹽(OPD)美國Sigma公司；N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)品安譜實(shí)驗(yàn)科技股份公司；乙腈（色譜純）Fisher Chemical公司；甲酸、乙酸（色譜純）賽默飛世爾科技公司；NaHSO 3（分析純）阿達(dá)瑪斯試劑公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫為30℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10μL；采集時(shí)間：17 min；檢測器為熒光檢測器，激發(fā)波長：337 nm，發(fā)射波長：448 nm;流動相A為超純水；流動相B為乙腈；流動相洗脫程序(如表1所示)。

表1流動相的洗脫程序

1.3.2溶液配制

1.3.2.1衍生化試劑的制備

首先準(zhǔn)確稱量0.209 g NaHSO 3于10mL的容量瓶中，加蒸餾水定容到10 mL，配制成0.2 mol/L的NaHSO 3溶液。然后稱取0.1 g OPD試劑，并在避光下加入10 mL配置好的0.2 mol/L的NaHSO 3溶液中，震蕩直到全部溶解，即配制成了10 mg/mL的鄰苯二胺鹽酸鹽溶液。

1.3.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液。之后分別配制成0.5，1，10，50，200μg/mL的溶液，并取出1 mL加入200μL的衍生化試劑，并于80℃水浴100 min，然后冷卻到室溫，再用0.22μm濾膜過濾，取濾液，得到所需的N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.3樣品前處理

精準(zhǔn)稱取奶粉1 g，置于50 mL離心管中，再加入10 mL的溫水（50～60℃)溶解。渦旋后取出600μL置于1.5 mL離心管中，并加入600μL 0.1 mol/L的甲酸溶液進(jìn)行酸水解，充分振蕩搖勻，置于80℃下水浴180 min，然后冷卻到室溫，在13 000 r/min的條件下離心10 min。取1 mL上清液于新的1.5 mL離心管中，加入200μL濃度為10 mg/mL鄰苯二胺溶液，搖勻后置于80℃水浴下衍生100 min，冷卻，再將其在13 000 r/min的條件下離心10 min，取1 mL上清液并用0.22μm一次性針頭式濾頭過濾，裝瓶待測。

1.3.4專屬性

取1 mL 200μg/mLN-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和1 mL衍生化試劑OPD的水溶液，按上述的色譜條件進(jìn)樣測定。

1.3.5線性關(guān)系與檢測限

稀釋N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,得到質(zhì)量濃度分別為0.5，1，10，50，200μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測定，橫坐標(biāo)選取標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(X)，縱坐標(biāo)選取峰面積(Y)，并繪制線性回歸曲線。然后根據(jù)信噪比S/N=3測出最低檢出限。

1.3.6精密度

取1 mL 100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，平行制備6份樣品溶液，在上述色譜條件下分析，記錄色譜圖，選取目標(biāo)色譜峰，測定保留時(shí)間及其峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.7重復(fù)性

取1 mL 100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件連續(xù)測試6次，記錄色譜圖，選取目標(biāo)色譜峰，測得峰面積值，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.8穩(wěn)定性

取1 mL 100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4℃條件下分別放置0，1，2，4，6，8，10 h后，按上述色譜條件分別進(jìn)樣分析，測得峰面積值，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.9加樣回收率

取已知含量的同一供試品3份，每份中分別加入高、中、低三個(gè)體積濃度的N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（10，50，200μg/g），平行測定3次，按上述色譜條件下進(jìn)行測定，計(jì)算待測組分N-乙酰神經(jīng)氨酸的加樣回收率。

1.3.10樣品檢測

按照1.3.3的前處理方法和1.3.1的色譜條件方法，測定市售的6種奶粉中唾液酸的含量。

2結(jié)果與討論

2.1高效液相色譜條件的優(yōu)化

文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜方法流動相為甲醇-乙腈-超純水7∶8∶85，等度洗脫。但是這種方法檢測耗時(shí)較長（Neu5Gc和Neu5Ac出峰時(shí)間分別為12 min和16 min左右），同時(shí)三相流動相較為復(fù)雜，所以對液相方法的流動相進(jìn)行優(yōu)化。

流動相A為超純水，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫，之后嘗試將流動相水和乙腈變換成甲醇和水，結(jié)果表明兩種物質(zhì)的出峰時(shí)間均延遲，Neu5Gc的出峰時(shí)間從4.5 min延遲到9.5 min，Neu5Ac的出峰時(shí)間從4.8 min延遲到10.0 min。所以選擇水-乙腈流動相。如圖1為最終優(yōu)化的液相條件下200mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。

圖1 200 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2衍生化條件的優(yōu)化

2.2.1衍生化溫度的優(yōu)化

取1 mL100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入200μL OPD衍生溶液，分別置于40，50，60，70，80℃下，450 r/min混勻震蕩40 min。反應(yīng)后迅速將衍生后的標(biāo)品避光冰水浴，冷卻至室溫，經(jīng)0.22μm的過濾器過濾至進(jìn)樣瓶中，按1.3.1的色譜條件方法測定。從圖2中可以看出，隨著衍生化溫度的升高，峰面積逐漸增加，所以選擇80℃作為最優(yōu)衍生化溫度。

圖2 OPD衍生化溫度優(yōu)化圖

2.2.2衍生化時(shí)間的優(yōu)化

取1 mL 100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入200μL OPD衍生溶液，在80℃，450 r/min混勻震蕩20，40，60，80，100，120，140，160 min。反應(yīng)后迅速將衍生后的標(biāo)準(zhǔn)品避光冰浴，冷卻至室溫，經(jīng)0.22μm的過濾器過濾至進(jìn)樣瓶中，按1.3.1的色譜條件方法測定。從圖3中看到，當(dāng)溫度恒定80℃不變，在20～100 min內(nèi)，峰面積逐漸增加，達(dá)到100 min后，峰面積有下降的趨勢，所以選擇100 min為最優(yōu)衍生化時(shí)間。

2.3樣品前處理的優(yōu)化

取2份同等體積的奶粉溶液，分別加入等體積的酸（1 mol/L甲酸，2 mol/L乙酸）進(jìn)行水解。結(jié)果表明1 mol/L甲酸，80℃，3 h比2 mol/L乙酸，80℃，3 h水解效果更好，所以最終選擇1 mol/L甲酸80℃，3小時(shí)為樣品酸水解條件。

2.4專屬性

如圖4所示，N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間約在6.3 min左右，并且OPD試劑的峰圖對于檢測N-乙酰神經(jīng)氨酸無影響，所以專屬性符合要求。

2.5線性關(guān)系及檢出限

圖3 OPD衍生化時(shí)間優(yōu)化圖

圖4 OPD色譜圖（a）；Neu5Ac標(biāo)品色譜圖（b）

以各峰面積為縱坐標(biāo)(Y)各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(μg/g)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線，如圖5所示，Neu5Ac的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.3588x-0.8002，R 2=0.9994?？梢缘贸鰳?biāo)準(zhǔn)品在0.2～200μg/g濃度范圍內(nèi)，與峰面積的線性關(guān)系較好。檢測結(jié)果按照三倍信噪比（S/N=3）進(jìn)行計(jì)算，得到Neu5Ac的檢出限為0.5μg/g。

圖5 N-乙酰神經(jīng)氨酸的線性關(guān)系圖

2.6精密度

精密度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表2顯示，其RSD=1.99%，結(jié)果表明儀器精密度良好，符合技術(shù)要求。

2.7重復(fù)性

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表3顯示，其RSD=1.30%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

表2精密度結(jié)果

表3重復(fù)性結(jié)果

2.8穩(wěn)定性

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，表明衍生物在8 h內(nèi)穩(wěn)定，所以分析時(shí)應(yīng)在8 h內(nèi)完成。

表4穩(wěn)定性結(jié)果

2.9加樣回收率

加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，結(jié)果顯示，高、中、低三個(gè)水平Neu5Ac的加標(biāo)回收率在98%～119%范圍內(nèi)，說明該方法符合要求，準(zhǔn)確性較好。

表5 N-乙酰神經(jīng)氨酸的回收率結(jié)果

2.10樣品分析

按照上述優(yōu)化方法對嬰幼兒奶粉樣品進(jìn)行處理，以最終優(yōu)化方法完成的HPLC方法條件對樣品進(jìn)行N-乙酰神經(jīng)氨酸含量測定。本實(shí)驗(yàn)測定6種不同的奶粉，且唾液酸含量如表6所示。從表格中可以看出6種不同奶粉唾液酸含量差距較大，這是因?yàn)槟谭壑型僖核岷颗c奶牛的品種，飲食方式，以及它們的成長環(huán)境有著密切的關(guān)系。

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)的分析優(yōu)化方法，確定了N-乙酰神經(jīng)氨酸的水解方法：將奶粉溶液在1 mol/L的甲酸在80℃下酸解3 h，再加入衍生化試劑鄰苯二胺鹽(OPD)在80℃下衍生化100 min，然后采用HPLC-FLD進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)色譜條件的選擇：流動相采用超純水-乙腈，流速設(shè)置為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積是10μL，柱溫控制在30℃，在此情況下能夠得到較好的峰形。并且在該方法下分析了不同種奶粉的N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量，可以看出不同的奶粉唾液酸含量差距較大，這是因?yàn)槟膛５娘嬍撤绞剑膛５姆N類品種，以及奶牛成長的環(huán)境有關(guān)。這種方法具有步驟簡單，快速便捷，定量準(zhǔn)確，節(jié)省成本的特點(diǎn)，能夠?yàn)榻窈驨-乙酰神經(jīng)氨酸的含量檢測研究提供參考依據(jù)。

表6 6種不同的奶粉中Neu5Ac含量