澹臺瑋，徐秦峰，馬西亞，張文娟

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院國家羊乳制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，西安710021）

0引言

乳制品營養(yǎng)豐富，易被人體消化吸收，同時作為加工食品原輔料的重要來源，在世界各地有著巨大的消費群體[1]。尤其是羊乳以其更高的營養(yǎng)價值使得其價格遠(yuǎn)高于牛乳[2]。一些不法商家為了尋求商業(yè)利益，在羊乳中摻入牛乳，以次充好，且摻入手段多樣，不易辨別。這種摻假行為不僅會給消費者造成直接的經(jīng)濟損失，而且還涉及到某些特殊的醫(yī)療要求、食物過敏甚至是宗教信仰問題[3]。因此，建立牛、羊源性的品種鑒別方法以保證乳品真實性是必要的。

目前用于乳制品來源鑒別方法主要有分析蛋白、脂肪和核酸的方法，這些方法在一定程度上都可以實現(xiàn)牛、羊乳品種鑒別[4]。但是，相比于蛋白質(zhì)和脂肪，核酸分子的穩(wěn)定性更高，且在個體細(xì)胞間具有良好的保守性[5-6]。因此基于DNA的檢測方法不僅適用于生乳樣品，也適用于熱加工的乳品[7]?；诤怂岚l(fā)展的牛、羊乳的品種鑒別技術(shù)有普通PCR[8]、real-time PCR[9]等，但大多操作繁雜，設(shè)備昂貴，且需專業(yè)操作人員才能完成。Notomi等[10]研發(fā)的一種新型核酸擴增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）通過4條特異性引物，快速識別靶序列上的6個位點，結(jié)合具有鏈置換活性的DNA聚合酶，實現(xiàn)在恒溫條件下，特異、高效、快速地擴增核酸序列，已被成功應(yīng)用于物種鑒定。Deb R等[11]通過對LAMP反應(yīng)體系進行優(yōu)化，實現(xiàn)在2 h內(nèi)對羊奶/肉類樣品中摻入5%牛成分的檢測。Cho A R等[12]建立了LAMP熔解曲線分析方法，實現(xiàn)對8種肉制品進行了識別和鑒定。然而，這些研究都需要進行過程繁瑣、耗時較長的DNA提取過程，限制了對現(xiàn)場快速檢測的應(yīng)用。本研究建立了一種在不進行DNA提取的情況下直接實時LAMP檢測方法，同時檢測時可以采用更少量的樣品，實現(xiàn)對羊乳及其制品中摻入牛乳成分的檢測。

1材料與方法

1.1實驗材料

鮮奶牛乳樣品，西安市未央?yún)^(qū)草灘奶牛場；鮮羊乳樣品-20℃保存?zhèn)溆茫惺?；用于驗證引物特異性的非目標(biāo)DNA（雞、豬、馬、兔和鴿子）均購于四川華漢三創(chuàng)有限公司；不同品牌的羊乳產(chǎn)品（液態(tài)乳、羊奶片、全脂羊乳粉、淡奶粉及配方奶粉），市售，用于驗證所建立方法的實際應(yīng)用價值。

模擬摻假樣品的制備：將牛乳按不同比例摻入羊乳中（100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%、0%），制備成具有不同含量的模擬摻假樣品。

1.2主要試劑和儀器

(1)試劑：磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒購自天根有限公司；甜菜堿（Sigma公司）；dNTP混合液，Bst 2.0 WarmStar DNA聚合酶，MgSO 4，均采自New England Biolabs。

(2)儀器：高速冷凍離心機（5424R），Eppendorf有限公司；瓊脂糖水平電泳儀（DYCP-31DN），北京六一生物科技有限公司；電熱恒溫水槽（DK-8D），上海精宏實驗設(shè)備有限公司，熒光定量PCR儀（qTOWER 2.2），德國耶拿分析儀器股份公司；超微量分光光度計（Q 6000），美國Quawell。

1.3 DNA提取

按照磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒說明書，提取新鮮乳品或乳粉中的DNA，采用超微量核酸定量儀測定DNA的濃度和純度后，將DNA溶液稀釋到7 ng/μL，保存于-20℃冰箱中備用。

1.4 LAMP引物設(shè)計及篩選

本研究涉及的牛、羊特異性引物以線粒體保守序列為靶基因，依據(jù)引物設(shè)計原則使用PrimerExplorerV4在線設(shè)計并進行實驗的可行性驗證，經(jīng)過多次設(shè)計及篩選比對，最終使用SN/T 4419.21-2016[13]標(biāo)準(zhǔn)中的牛特異性引物及文獻報道的羊特異性引物[14]，如表1所示。引物由生工生物(上海)有限公司合成。

1.5 LAMP反應(yīng)體系建立

LAMP反應(yīng)體系為10μL，包括:1μL 10×Thermol Pol buffer，外引物F3和B3（10μmol/L）各0.2μL，內(nèi)引物FIP和BIP（40μmol/L）各0.2μL，1.4μL dNTPs（10 mmol/L），1.6μL甜菜堿（0.8M），0.4μL MgSO 4（100 mmol/L），0.4μL Bst DNA聚合酶（8 U/μL），20×Eva Green熒光染料0.25μL，加入待測DNA 1.2μL，以超純水為空白對照，最后用水補齊到10μL，混勻。反應(yīng)條件：64℃恒溫反應(yīng)45 min。

表1本實驗中LAMP擴增引物序列

1.6直接實時LAMP反應(yīng)體系建立

對于直接實時LAMP反應(yīng)體系，所有的待測樣品都不需要進行DNA提取。首先取5μL樣品（對市售的羊奶粉，取0.1 g奶粉溶于1 mL水中混勻，制成液態(tài)乳）放入含有55μL磷酸鹽（PBS）緩沖液的PCR反應(yīng)管中，在98℃下孵育5 min，然后取1.2μL上層清液直接作為模板用于上述LAMP反應(yīng)。

1.7特異性試驗

分別提取牛、羊、雞、豬、馬、兔、鴿子的DNA為模板，按照LAMP體系配置反應(yīng)液，加入不同模板DNA，在最適反應(yīng)溫度下擴增，結(jié)果通過擴增曲線及2%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析鑒定，以驗證LAMP引物的特異性。

1.8靈敏度試驗

將DNA提取液進行10倍梯度稀釋，使反應(yīng)體系中DNA濃度分別為7、0.7、0.07、0.007、0.0007、0.00 007 ng/μL，將每個梯度的稀釋液取1.2μL作為模板進行LAMP反應(yīng)檢測，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進行單個物種DNA檢測靈敏度的測定。

2結(jié)果與分析

2.1特異性檢測

采用牛、羊、雞、豬、馬、兔、鴿子等樣品DNA為模板，進行LAMP反應(yīng)，以驗證引物的特異性，擴增曲線如圖1所示，針對牛、羊源性成分設(shè)計的特異性引物，僅含有目標(biāo)成分DNA檢測結(jié)果為陽性，空白對照和其他動物源性樣品均未發(fā)生擴增，結(jié)合凝膠電泳結(jié)果顯示，只有牛、羊乳DNA中分別加入牛、羊特異性引物才出現(xiàn)典型的梯形條帶（圖1中的泳道1），與擴增曲線結(jié)果一致，表明LAMP引物的特異性良好。

2.2靈敏度檢測

為了確定設(shè)計的LAMP方法能夠檢測到的牛、羊乳DNA的含量，將10倍稀釋的牛、羊源性成分DNA（7 ng/μL、0.7 ng/μL、0.07 ng/μL、0.007 ng/μL、0.0 007 ng/μL、0.00 007 ng/μL）分別用于LAMP反應(yīng)，以超純水作為空白對照。圖2結(jié)果表明，牛源性成分檢測的靈敏度可達到0.07 pg/μL，羊源性成分檢測的靈敏度可達到0.7 pg/μL，表明檢測體系具有較高的靈敏度。同時，牛、羊源性成分濃度與LAMP方法檢出時間具有良好的線性關(guān)系，隨著模板DNA濃度的降低，其檢出時間越長。

圖1牛、羊源性成分LAMP引物特異性驗證

圖2牛、羊源性成分LAMP反應(yīng)靈敏度檢測

2.3實時LAMP技術(shù)對摻假樣品檢測

考慮牛源性成分為羊乳中最為常見的摻假成分，為了確定其檢出限，將試劑盒提取的羊乳DNA稀釋液制成混合樣品（摻入牛乳DNA含量分別為100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%），使用牛特異性引物進行LAMP擴增。從圖3可以看出，以不同比例的DNA混合液為模板，均可以出現(xiàn)明顯的擴增曲線，表明本方法對羊乳中摻入牛源性成分的檢測限為0.1%。

圖3牛羊乳DNA混合樣品中牛源性成分分析（1～9分別為摻入牛乳DNA比例為100%、80%、50%、10%、5%、1%，0.1%、0%和空白對照）

2.4直接實時LAMP技術(shù)對摻假樣品檢測

為了驗證建立的直接實時LAMP方法的應(yīng)用性，將牛乳按不同比例摻入羊乳中（100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%、0%），制備成不同含量的混合樣品，每個樣品只需孵育5分鐘，使細(xì)胞裂解釋放出DNA，然后直接作為模板進行LAMP擴增。結(jié)果如圖4所示，建立的直接實時LAMP方法可成功對乳制品進行檢測，在不同比例的混合樣品中，該方法能檢測出羊乳中低至1%的牛乳成分，明顯低于由試劑盒提取的DNA制成混合樣品的檢出限。這是因為乳體系內(nèi)部的復(fù)雜性和乳中體細(xì)胞含量分布的不均勻性，將乳混和直接進行擴增時會有部分損失。

圖4牛羊乳直接混合樣品中牛源性成分分析（1～9分別為摻入牛乳比例為100%、80%、50%、10%、5%、1%，0.1%、0%和空白對照）

2.5實際樣品檢測

為了驗證直接實時LAMP方法對市售樣品檢測的適用性，采用上述建立的檢測體系對10種商業(yè)乳品進行直接檢測，并通過試劑盒提取DNA的實時LAMP方法驗證其準(zhǔn)確性，檢測結(jié)果見表2。結(jié)果表明，三個商業(yè)乳品(樣品1、2、3)標(biāo)記為只含有羊乳被加有牛特異性引物的LAMP反應(yīng)體系擴增，顯示了在羊乳中不同程度的摻入牛乳成分；而標(biāo)識有生羊乳、乳清粉的樣品8僅檢測出牛乳成分，與標(biāo)識的主成分不符。盡管牛乳清粉在羊奶粉中的添加和替換一直存在，但是錯誤標(biāo)注會對過敏人群造成危害[15-16]。同時，直接實時LAMP與經(jīng)DNA提取的實時LAMP反應(yīng)相比，結(jié)果完全一致，但檢測時間均有延遲，根據(jù)Tanner N A等人[17]對實時LAMP檢測研究表明，在某些引物不足或不純樣品（即樣品直接作為模板擴增）情況下時間閾值范圍可在45-60 min，即為陽性結(jié)果，對比該研究表2可以發(fā)生擴增反應(yīng)的時間可作為判定方式，即時間閾值小于60 min，為陽性結(jié)果，反之，則為陰性。相較于通過試劑盒提取乳中DNA到LAMP結(jié)果檢測，簡化了實驗過程，縮短了時間。本實驗證明了直接實時LAMP方法在不提取DNA的情況下實現(xiàn)對牛羊乳成分進行檢測的能力，并且適用于現(xiàn)場快速檢測。因此，本研究可實現(xiàn)對市售羊乳制品中摻入牛源性成分的檢測。

表2市售羊乳制品中牛、羊乳成分的LAMP檢測

3結(jié)論

現(xiàn)如今，羊乳及其制品摻入牛源性成分鑒別是乳制品質(zhì)量安全控制面臨的重要挑戰(zhàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3050-2016《羊奶真實性鑒定技術(shù)規(guī)程》規(guī)定，基于DNA的PCR方法，適用于生羊奶、UHT滅菌液態(tài)羊奶及羊奶粉中摻入牛源性奶成分的定性檢測。但是該PCR方法需要專門的儀器以及復(fù)雜的DNA提取過程，無法實現(xiàn)羊奶真實性的現(xiàn)場快速檢測，限制了此方法的推廣應(yīng)用。LAMP法作為一種新興分子生物學(xué)方法，無需復(fù)雜的熱循環(huán)體系，僅在恒溫條件下擴增，因其高效、快速、便捷的特點已應(yīng)用于動物源性成分及多種致病菌的檢測[18-20]。本研究根據(jù)線粒體保守序列選取牛、羊特異性引物，建立了快速鑒別羊乳及其制品摻假的直接實時LAMP檢測方法，該方法具有良好的特異性，僅對含有目標(biāo)成分的樣品有擴增，對其他動物源性成分沒有交叉反應(yīng)。該方法對牛、羊源性成分的檢測靈敏度可達到0.07 pg/μL和0.7 pg/μL。對羊乳中摻入不同比例牛乳混合物進行5min熱處理，可檢測出摻入1%的牛乳，能夠滿足羊乳中摻入牛源性成分的檢測。通過對市售羊乳及其制品中摻入牛源性成分的檢測，無需核酸提取的直接實時LAMP檢測結(jié)果與實時LAMP技術(shù)結(jié)果相一致，在1 h內(nèi)即可對樣品進行鑒定，極大地簡化了實驗過程，縮短了時間，同時直接實時LAMP技術(shù)無需核酸提取，減少了樣品DNA提取過程的污染風(fēng)險，同時檢測時僅需采用更少量的樣品即可實現(xiàn)乳制品中牛、羊源性成分的現(xiàn)場快速檢測。