齊新文

遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬（珠海）醫(yī)院骨二科，廣東 珠海 519100

激素性股骨頭壞死（Steroid-induced avascular necrosis of the femoral head,SANFH）是因長期大劑量應(yīng)用激素所引致的一種代謝性疾病［1］，其致殘性高，對社會產(chǎn)生較大影響［2］。因此，尋求針對SANFH有效的治療方法，具有重要的臨床意義［3］。本研究通過經(jīng)耳緣靜脈注射的方式移植經(jīng)Brdu標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞（Adipose mesenchymal stem cells，ADSCs），觀察ADSCs在壞死股骨頭區(qū)的定植情況及其對SANFH的修復(fù)效果，試圖尋求一種有效干預(yù)SANFH的新方法，研究結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45只體重為2.5～3.0 kg的雄性新西蘭大白兔，均為8月齡，于廣東省實驗動物中心購買，許可證號為SCXK(粵)20140035。各兔單獨分籠飼養(yǎng)，自由飲水及進(jìn)食飼料。實驗中所有操作與動物倫理學(xué)要求相符。

1.2 實驗試劑及儀器

溴脫氧尿嘧啶核苷（Bromodeoxyurdine，BrdU）（廣州璽美生物科技有限公司）；馬血清（SH30074.03，Hyclone）；DMEM培養(yǎng)基（SH30243.01，Hyclone）； 125mg注射用甲基強的松龍（武漢新星生物藥業(yè)有限公司）；離心機（Thermo-ST16,上海仁器儀器公司）;石蠟切片機（RM2235,德國Leica公司）；電子顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 方法

1.3.1 建立兔激素性股骨頭壞死模型：從實驗兔中隨機選取3只兔作分離ADSCs用，均不用于造模，余42兔作為建模兔。將各建模兔經(jīng)耳緣靜脈注射10 ml/kg馬血清，3周后各兔經(jīng)耳緣靜脈注射5 ml/kg馬血清。最后一次注射馬血清后兩周，經(jīng)腹腔注射5 ml/kg甲基強的松龍，連續(xù)注射3 d，兩周后各建模兔麻醉后完善髖部正位片及髖部磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）檢查了解股骨頭情況。以髖關(guān)節(jié)正位片見股骨頭密度欠均勻、囊性變，同時髖部MRI見股骨頭軟骨下帶狀低信號，關(guān)節(jié)積液增多，認(rèn)為兔激素性股骨頭壞死模型建立成功［4］。

1.3.2 建模后分組：隨機選取36只造模成功的兔進(jìn)行隨機分組，分為靜脈注射組、局部注射組及對照組，每組各12只兔。

1.3.3 兔ADSCs的提取及培養(yǎng)傳代：將非造模兔經(jīng)耳緣靜脈注射10%水合氯醛（劑量為1.5 ml/kg）充分麻醉后，將兔固定于固定板上，消毒后從頸項部切取約3 g脂肪組織。磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖冼3次后剪至糊狀放入無菌瓶中，加入0.1%Ⅰ型膠原酶溶解，吸出溶液5 ml，并同量完全培養(yǎng)基一起加入到15 ml離心管中離心5 min，過濾后接種于培養(yǎng)瓶中，置入培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）培養(yǎng)，將細(xì)胞傳代至第3代。將第3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)鑒定確認(rèn)為ADSCs。

1.3.4 溴脫氧尿嘧啶核苷（Bromodeoxyurdine，BrdU）標(biāo)記ADSCs并制成細(xì)胞溶液：取第3代ADSCs接種于T25培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為1×105/cm2。待細(xì)胞匯合度達(dá)80%，往培養(yǎng)瓶中加入100μl濃度為10μmol/L的BrdU，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h。將ADSCs經(jīng)消化離心后，加入單純高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成1×107/ml的細(xì)胞懸液備用。

1.3.4 兔ADSCs移植干預(yù)兔激素性股骨頭壞死：局部注射組：將各兔左髖部備皮、消毒并鋪無巾后，依次置于X線機下，俯臥位，充分固定四足后，使用5 ml注射器從左髖關(guān)節(jié)刺入，X線機攝片證實注射器尖端已達(dá)股骨頭后，注入 5ml經(jīng)BrdU標(biāo)記的ADSCs。靜脈注射組：將兔右耳緣靜脈局部充分備皮后，經(jīng)耳緣靜脈注入5 ml已標(biāo)記BrdU的ADSCs。對照組不作任何干預(yù)。

1.3.5 干預(yù)后4周、8周各組兔股骨頭組織學(xué)分析：于干預(yù)后第4周、第8周各組隨機選取6只模型兔，處死后切取各組兔左側(cè)股骨頭將各兔左側(cè)股骨頭進(jìn)行脫鈣、脫水、透蠟并包埋，切片脫蠟至水。將各兔股骨頭切片分成兩部份，一部份作HE染色，100倍顯微鏡下觀察各組兔兩時間點股骨頭骨陷窩、骨小梁情況，并計算空骨陷窩率；一部份作Brdu免疫組化染色，100倍顯微鏡下觀察BrdU標(biāo)記的ADSCs經(jīng)靜脈移植后在病變股骨頭的定植情況，并計數(shù)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)量。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，干預(yù)后同一時間點各組間比較，采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔激素性股骨頭壞死模型的建立情況

42只大白兔經(jīng)靜脈注射馬血清聯(lián)合腹腔注射甲基強的松龍后，2兔出現(xiàn)死亡，考慮腹腔注射后出現(xiàn)感染所致，共37兔建模成功。

2.2 各組兔干預(yù)后4周、8周股骨頭組織形態(tài)變化

干預(yù)后4周：對照組可見較多空骨陷窩及脂肪細(xì)胞、骨小梁稀疏，而局部注射組、靜脈注射組空骨陷窩及脂肪細(xì)胞數(shù)量較對照組少，骨小梁稍稀疏。

干預(yù)后8周：對照組可見空骨陷窩及脂肪細(xì)胞數(shù)量較干預(yù)后4周增多，部分脂肪細(xì)胞已融合成團，可見骨小梁斷裂；局部注射組及靜脈注射組可見空骨陷窩及脂肪細(xì)胞數(shù)量極少，骨小梁較致密。

2.3 各組兔干預(yù)后4周、8周股骨頭空骨陷窩率測定

于干預(yù)后4周、8周分別測量各組兔股骨頭空骨陷窩率，結(jié)果可見干預(yù)后4周、8周局部注射組及靜脈注射組的空骨陷窩率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而局部注射組與靜脈注射組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)后8周局部注射組及靜脈注射組空骨陷窩率均低于同組干預(yù)后4周，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 干預(yù)后4周、8周各組股骨頭空骨陷窩率（） %

表1 干預(yù)后4周、8周各組股骨頭空骨陷窩率（） %

注：*表示在干預(yù)后4周與對照組比較，P＜0.05；#表示在干預(yù)后8周與對照組比較，P＜0.05。

P t組別對照組（n=6）局部注射組（n=6）靜脈注射組（n=6）10.94 14.49 18.26 0.00 0.00 0.00 FP干預(yù)后第4周44.77±1.27 37.45±0.84*36.87±0.45*137.76 0.00干預(yù)后第8周50.35±0.57 32.40±0.46#31.93±0.47#2633.50 0.00

2.4 各組兔干預(yù)后4周、8周后Brdu免疫組化染色

于干預(yù)后4周、8周，局部注射組及靜脈注射組可見細(xì)胞核呈棕褐色的Brdu標(biāo)記陽性細(xì)胞，并隨時間推移，陽性細(xì)胞增多。對照組于干預(yù)后第4周、第8周均未見經(jīng)Brdu標(biāo)記的陽性細(xì)胞。干預(yù)后8周局部注射組及靜脈注射組Brdu陽性細(xì)胞數(shù)均高于同組干預(yù)后4周（P＜0.05）；而于干預(yù)后4周、8周局部注射組與靜脈注射組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 干預(yù)后4周、8周各組Brdu陽性細(xì)胞數(shù)（） %

表2 干預(yù)后4周、8周各組Brdu陽性細(xì)胞數(shù)（） %

注：*表示與同組干預(yù)后4周作比較，P＜0.05。

組別局部注射組（n=6）靜脈注射組（n=6）t P 0.00 0.00干預(yù)后8周35.19±1.01*34.78±1.56*0.60 0.56干預(yù)后4周23.23±1.03 22.87±1.75 0.49 0.64 22.74 13.913 tP

3 討論

SANFH是骨科臨床常見的難治性疾?。?］，目前其保髖治療方法如藥物及物理治療、高壓氧治療、髓芯減壓手術(shù)治療等均能起一定的療效，但遠(yuǎn)期效果仍欠滿意［6］。目前已有研究指出局部注射移植干細(xì)胞可對激素性股骨頭壞死起較好的修復(fù)效果，其主要修復(fù)機制考慮與干細(xì)胞的多向分化能力促進(jìn)骨修復(fù)及其分泌因子促進(jìn)局部血管生成有關(guān)［7］，干細(xì)胞療法有望成為治療SANFH的良好療法［8］。本研究通過操作簡單的經(jīng)耳緣靜脈注射方法，移植干細(xì)胞種類中易獲取、增殖能力強的ADSCs，觀察ADSCs在股骨頭的歸巢及其對股骨頭壞死的修復(fù)效果，探討靜脈注射ADSCs修復(fù)SANFH的可行性，目前該方面的研究國內(nèi)外報道較少。

從Brdu免疫組化結(jié)果可得，干預(yù)后4周及干預(yù)后8周靜脈注射組均可見Brdu陽性細(xì)胞，并且隨著時間延長，陽性細(xì)胞會隨著增多，說明經(jīng)耳緣靜脈注射的ADSCs可逐漸定植于壞死股骨頭區(qū)，并且從統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果可得，其定植數(shù)量與經(jīng)局部注射移植無明顯差異，說明經(jīng)靜脈注射ADSCs可在股骨頭達(dá)到與局部注射相近的細(xì)胞濃度。但經(jīng)靜脈注射的ADSCs如何經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)有血運障礙的股骨頭區(qū)，具體機制需進(jìn)一步研究。有研究指出，干細(xì)胞可特異性地歸巢于缺血或損傷的組織中［9］，這主要與組織缺血損傷后分泌的趨化因子及黏附分子有關(guān)［10］。經(jīng)靜脈注射進(jìn)入血液循環(huán)中的ADSCs，可能受到壞死股骨頭區(qū)分泌趨化因子及黏附分子的作用，從而定植于股骨頭區(qū)。

從組織學(xué)分析結(jié)果可見，于干預(yù)后4周、8周，局部注射組及靜脈注射組脂肪細(xì)胞數(shù)量均明顯比對照組少，而骨小梁均較對照組致密，空骨陷窩率兩干預(yù)組均低于對照組，但兩干預(yù)組的鏡下組織學(xué)表現(xiàn)與空骨陷窩率均無明顯差異?？梢娊?jīng)耳緣靜脈注射ADSCs可對兔SANFH具有一定的修復(fù)效果，并且可能達(dá)到與局部移植相近的修復(fù)效果。

綜上所述，經(jīng)耳緣靜脈移植ADSCs可定植于股骨頭區(qū)，對SANFH有一定的修復(fù)作用。