鄭賢靜，金成華*，梁承武

(1.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 133002;2.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

四氮唑類化合物是含有四個(gè)氮原子的五元芳香雜環(huán)化合物，是一類在藥物有機(jī)合成中非常重要的中間體，目前四氮唑化合物應(yīng)用最為廣泛的包括1位取代、5位取代和1,5位取代四氮唑衍生物[1]。四氮唑化合物結(jié)構(gòu)修飾主要在1，5號(hào)位上進(jìn)行，并且在抗菌領(lǐng)域以及抗高血壓領(lǐng)域主要發(fā)揮作用的也是1，5號(hào)位修飾的四氮唑化合物，作為中間體進(jìn)行研究[2]。

近年來(lái)在抗菌藥物領(lǐng)域,四氮唑化合物結(jié)構(gòu)作為側(cè)鏈結(jié)構(gòu)修飾被引入頭孢類抗生素的應(yīng)用中,特別是第三代、第四代頭孢類抗生素頭孢類藥物，如氟氧頭孢、頭孢咪唑、頭孢呱酮頭孢替安等，都表現(xiàn)出良好的抗菌活性[3]。

溴化鋅可以催化以芐基疊氮和苯甲酰氰為原料的[2+3]環(huán)加成，這是一種合成四氮唑的實(shí)用方法,操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高[4]。本研究合成出7個(gè)芐基四氮唑類衍生物，并用生長(zhǎng)速率法測(cè)定化合物的殺菌活性。

1 材料與方法

1.1 路線設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)四氮唑化合物1，5號(hào)位修飾進(jìn)行合成研究，如scheme 1，以苯甲酰氯和芐基氯為原料，通過(guò)親核取代反應(yīng)合成出苯甲酰氰化合物(2)和芐基疊氮化合物(4)[5]，最終以溴化鋅為催化劑合成化合物5。在scheme 2所示，以不同的合成路線，以苯甲酰氯為原料，先與疊氮化鈉進(jìn)行[2+3]環(huán)合為四氮唑類化合物[6]，然后與芐基氯進(jìn)行親核取代，最終合成化合物5等衍生物。

Scheme 1(a):三甲基氰硅烷,碘化鋅,100 ℃,2 h;(b)疊氮化鈉，N,N-二甲基甲酰胺,甲苯,75 ℃,3.5 h;(c):溴化鋅2,N,N-二甲基甲酰胺,回流20 h。

R=a:-H,b:4-CH3,c:4-OCH3,d:4-Cl,e:4-F,f:4-Br,g:4-OH

Scheme 2(a):三甲基氰硅烷,碘化鋅,100 ℃,2 h;(c):溴化鋅2,N,N-二甲基甲酰胺,回流,20 h;(d)疊氮化鈉，N,N-二甲基甲酰胺,甲苯,75 ℃,5 h。

R=a:-H,b:4-CH3,c:4-OCH3,d:4-Cl,e:4-F,f:4-Br,g:4-OH

1.2 儀器與試劑

JH21O2電子天平；IBUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DZF-6050型真空干燥箱；KQ-C玻璃儀器氣體烘干箱；DLSB-5/25 ℃(KEER)冷凝器；BHX-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵(南京科爾儀器設(shè)備有限公司)；Bruker Avance-500型核磁共振譜儀(均以CDCl3為溶劑,TMS為基準(zhǔn)物質(zhì))。

苯甲酰氯(98%，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)；芐基氯(98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；疊氮化鈉；二甲基甲酰胺(99%)；三甲基氰硅烷(98%，麥克林)；碘化鋅；溴化鋅(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，其余試劑均為分析純級(jí)別。

測(cè)試中所用到的革蘭陽(yáng)性菌包括：金黃色葡萄球菌(S.Aureus4220)、耐喹諾酮金黃色葡萄球菌、耐加氧西林金黃色葡萄球菌、白色念珠菌(Candidaalbicans7535)、變形鏈球菌(Streptococcusmutans3289)。革蘭陰性菌：大腸桿菌(E.coli1924)。其中對(duì)照藥選取加替沙星(Gatifloxacin)和莫西沙星(Moxifloxacin)作為參考。

1.3 合 成

1.3.1苯甲酰氰(2)的合成

安裝回流反應(yīng)裝置，加入1.05 g(10.46 mmol)三甲基氰硅烷，將苯甲酰氯1.5 g(10.46 mmol)緩慢滴加入三甲基氰硅烷中，加入催化劑量的碘化鋅16.73 mg(50 μmol)，攪拌條件下加熱到100 ℃，反應(yīng)2 h，薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。加入10.46 mL冰水，用乙酸乙酯10 mL萃取3次，合并油相，并用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓除去乙酸乙酯，得無(wú)色的油狀物質(zhì)化合物(2)，收率為70%。

1.3.2芐基疊氮(4)的合成

先安裝200 mL的兩口瓶，置于冰浴條件下，加入5.00 g(37.5 mmol)的芐基氯，加入4.93 g(3.753 mmol)的疊氮化鈉，加入溶劑16.11 mL的DMF和16.11 mL的甲苯，攪拌條件下加熱到70 ℃。保溫3.5 h，反應(yīng)結(jié)束，用薄層色譜檢測(cè)。加入150 mL去離子水，用甲苯(16.11 mL)萃取3次，合并油相甲苯，并用無(wú)水硫酸鈉干燥1 h，過(guò)濾，減壓除去甲苯。得化合物(4)，收率為68%。

1.3.3苯基(1H-四唑-5-基)甲酮(6)的合成

安裝100 mL的兩口瓶，將疊氮鈉0.742 g(11.42 mmol)加入到苯甲酰氰1.00 g(9.52 mmol)中，加入溶劑(DMF 5 mL)，加入催化量的溴化鋅，攪拌下加熱回流20 h，并用薄層色譜監(jiān)測(cè)。降溫到常溫，放入冰水中出現(xiàn)黃色的固體，加入0.73 mL HCl固體溶解，繼續(xù)攪拌2 h，又重新析出固體，然后過(guò)濾并用水洗。得終產(chǎn)物(6)，收率為62%。

1.3.4(1-芐基-1H-四唑-5-基)(苯基)甲酮(5)的合成通法

安裝100 mL的兩口瓶，將疊氮化芐基1.55 g(11.42 mmol)加入到苯甲酰氰1.00 g(9.52 mmol)中，加入溶劑(DMF 5 mL)，加入催化量的溴化鋅，攪拌下加熱回流20 h，并用薄層色譜監(jiān)測(cè)。降溫到常溫，再放入冰水中會(huì)出現(xiàn)黃色的固體，加入0.95 mL HCl固體溶解，繼續(xù)攪拌2 h，又重新析出固體，然后過(guò)濾并用水洗，得終產(chǎn)物(5)。

1.4 體外抗菌活性篩選

最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)是細(xì)菌在體外培養(yǎng)基上接種，在18～24 h內(nèi)能夠抑制其生長(zhǎng)所需的最低藥物濃度。這是一項(xiàng)常用的衡量化合物抗菌活性的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)合成的化合物進(jìn)行MIC活性的測(cè)試，并且對(duì)比它們結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系。

具體細(xì)篩操作過(guò)程：將5 mg的待測(cè)樣品溶于782 μL的DMSO中。在2 mL的MHB(Mueller-Hinton broth)培養(yǎng)基中將20 μL待測(cè)菌種接種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，之后在培養(yǎng)皿中用培養(yǎng)基將細(xì)菌稀釋為105CFU/mL。首先取100 μL的培養(yǎng)基于待測(cè)的96孔板中，根據(jù)二倍稀釋法原理，獲得一系列的樣品濃度為64～1 mg/L。之后向每個(gè)微孔內(nèi)加入100 μL的待測(cè)菌稀釋液，然后將96孔板放入650 nm的酶標(biāo)儀中，觀察記錄其吸光度。37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20～24 h后，再將96孔板放入酶標(biāo)儀中，記錄此時(shí)的吸光度。同一塊96孔板，根據(jù)前后吸光度的變化，運(yùn)用相應(yīng)的公式，計(jì)算出每種藥品的MIC值。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次。

2 結(jié) 果

2.1 合成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)合成，共得到了7個(gè)的芐基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物，化合物的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和質(zhì)譜確證。

(1-benzyl-1H-tetrazol-5-yl)(phenyl)methanone(5a)：yellow solid，yield 72%；m.p.80～83 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 8.40(d,2H),7.83-7.80(m,1H),7.55(m,2H),7.37-7.33(m,5H),3.46(s,2H)。m/z 265.28(M+)。

[1-(4-methylbenzyl)-1H-tetrazol-5-yl](phenyl)methanone(5b):yellow solid，yield 78%；m.p.91～93 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 8.39(d,2H),7.88-7.85(m,1H),7.58(m,2H),7.11(d,2H),7.01(d,2H),5.46(s,2H),2.19(S,3H)。m/z 279.41(M+)。

[1-(4-methoxybenzyl)-1H-tetrazol-5-yl](phenyl)methanone(5c):yellow solid，yield 66%；m.p.101～103 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 8.40(d,2H),7.85-7.82(m,1H),7.57(m,2H),7.10(d,2H),7.00(d,2H),5.44(s,2H),3.91(S,3H)。m/z 295.47(M+)。

[1-(4-chlorobenzyl)-1H-tetrazol-5-yl](phenyl)methanone(5d):yellow solid，yield 65%，m.p.105～107 ℃，1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 8.33(d,2H),7.73-7.71(m,1H),7.58(m,2H),7.12(d,2H),7.02(d,2H),5.48(s,2H)。m/z 299.70(M+)。

[1-(4-bromobenzyl)-1H-tetrazol-5-yl](phenyl)methanone(5e):yellow solid，yield 79%，m.p.118～121 ℃，1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 8.29(d,2H),7.77-7.70(m,3H),7.58-7.56(m,2H),7.03-7.05(d,2H),5.47(s,2H)。m/z 344.38(M+)。

[1-(4-fluorobenzyl)-1H-tetrazol-5-yl](phenyl)methanone(5f):yellow solid，yield 80%，m.p.104～106 ℃，1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 8.35(d,2H),7.72-7.70(m,1H),7.58-7.56(m,2H),7.14-7.11(m,4H),5.46(s,2H)。m/z 283.34(M+)。

[1-(4-hydroxybenzyl)-1H-tetrazol-5-yl](phenyl)methanone(5g):yellow solid，yield 56%，m.p.78～80 ℃，1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 9.08(s,1H),8.31(d,2H),7.73-7.71(m,1H),7.58-7.56(m,2H),6.95-6.92(d,2H),6.63-6.61(d,2H),5.49(s,2H)。m/z 281.30(M+)

2.2 抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究根據(jù)新藥設(shè)計(jì)拼合原理，共計(jì)合成了7個(gè)芐基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物。實(shí)驗(yàn)選用了3個(gè)不同取代基的化合物進(jìn)行抑菌活性研究，探究推電子效應(yīng)與吸電子效應(yīng)對(duì)芐基四氮唑類衍生物抗菌活性的影響。結(jié)果如表1所示，化合物5 d對(duì)所測(cè)細(xì)菌都表現(xiàn)出較好的抗菌活性，其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌4220和對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌1924的最低抑菌濃度均達(dá)到8 mg/L,弱于陽(yáng)性對(duì)照藥加替沙星和莫西沙星。另外，化合物5 d對(duì)真菌白色鏈球菌7535的抑菌濃度達(dá)到16 mg/L。

表 1 化合物對(duì)不同細(xì)菌的MIC(mg/L)

1.StaphylococcusaureusRN4220;2.Streptococcus mutans 3289;3.EscherichiacoliKCTC1924;4.Pseudomonasaeruginosa2742;5.SalmonellaentericaserovarTyphimurium2421;6.Candidaalbicans7535;7.Quinolone-resistantS.aureusCCARM3505;8.Methicillin-resistantS.aureusCCARM3506

3 討 論

四氮唑化合物的特性在作為官能團(tuán)時(shí)與羧酸相似,解離常數(shù)pKa值比較相近,空間結(jié)構(gòu)的平面離域體系也比較相近,可以很好地替代羧酸一類生物藥物在生物代謝過(guò)程中的作用。正因?yàn)樗牡蝾惢衔锞哂羞@些特殊的功能和結(jié)構(gòu)，所以關(guān)于四氮唑的研究越來(lái)越多[7]。20世紀(jì)50年代對(duì)于四氮唑化合物的合成及研究發(fā)展迅速，合成出的四氮唑類化合物大約300多種，使得其在藥物、農(nóng)業(yè)、化學(xué)和供能材料等方面得到廣泛應(yīng)用[8]。

構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)：苯環(huán)上Cl取代時(shí)，化合物表現(xiàn)出抗菌活性；苯環(huán)上取代基活性關(guān)系：4-Cl>4-F>4-CH3；苯環(huán)上的吸電子基團(tuán)活性大于供電子基團(tuán)。