李智磊，李靜嵐，陳纘光，王宇航，胡姍姍，楊秀娟*，王 勇*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 廣州 510280；2.深圳市第二人民醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 深圳 518035；3.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

鹽酸美金剛是一種非競爭性、電壓依賴性的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體抑制劑，是臨床治療中至重度阿爾茨海默病的主要藥物，具有降低β-淀粉樣蛋白毒性，減少小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)炎癥，增加星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放等作用[1]。鹽酸美金剛的含量測定對藥品質(zhì)量控制、生物醫(yī)學(xué)研究等具有重要意義。

由于鹽酸美金剛具有溶解度小、無紫外吸收等特性，因而無法以常用的高效液相色譜-紫外檢測器檢測[2]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的鹽酸美金剛含量測定方法主要有高效液相色譜-示差折光檢測法[2]、柱前衍生高效液相色譜法[3]、氣相色譜法[4]、酸性染料比色法[5]、激光誘導(dǎo)熒光檢測法[6]等。但高效液相色譜-示差折光檢測法的分析成本較高，試劑消耗量較大；氣相色譜法的分析成本也較高，分析時(shí)間較長；酸性染料比色法需藥物與額外的酸性染料絡(luò)合；激光誘導(dǎo)熒光檢測法與柱前衍生高效液相色譜法均需化學(xué)衍生化處理。因此，目前亟需一種成本低、試劑消耗少、方法簡單、檢測快速的鹽酸美金剛檢測方法。

微流控芯片是將反應(yīng)、分離、檢測等集成于微芯片上的一種新技術(shù)，具有分析速度快、樣品處理簡單、重復(fù)性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)[7]，已應(yīng)用于藥物與細(xì)胞相互作用、食品安全分析、臨床檢測、藥物篩選等多種領(lǐng)域[8-11]。其中，微流控芯片非接觸電導(dǎo)法是微流控芯片技術(shù)主流的檢測方法之一，在藥物分析方面具有較多應(yīng)用[12-16]，適用于需要快速化、便攜化、低成本測試的場景，但未見將該方法應(yīng)用于鹽酸美金剛測定的文獻(xiàn)報(bào)道。根據(jù)藥品標(biāo)準(zhǔn)查詢數(shù)據(jù)庫[17]，包括2015版中國藥典、部頒化學(xué)藥品與制劑等多種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，均無鹽酸美金剛相關(guān)的國家及地方的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)。因此本研究采用微流控芯片非接觸電導(dǎo)法建立了快速測定鹽酸美金剛片中鹽酸美金剛含量的方法，以期為鹽酸美金剛的現(xiàn)場質(zhì)量控制及質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考，同時(shí)也為鹽酸美金剛的醫(yī)藥學(xué)研究提供了一種新型的快速檢測方法。

圖1 微流控芯片及非接觸電導(dǎo)分析儀的結(jié)構(gòu)圖

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

μD-CCD/HV-2014型微流控芯片非接觸電導(dǎo)分析儀，包括高壓電源、非接觸電導(dǎo)檢測器和色譜工作站(中山大學(xué)藥學(xué)院研制);聚 甲 基 丙 烯 酸 甲 酯(PMMA)十字通道芯片(大連理工大學(xué)微系統(tǒng)研究中心，微通道上寬30 μm，下寬100 μm，深30 μm);微流控芯片非接觸電導(dǎo)分析儀與芯片結(jié)構(gòu)見圖1；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏儀市英峪予華儀器廠)；ME4001型十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

鹽酸美金剛片(聯(lián)邦制藥股份有限公司，批號：81216202、90216201、90316262，規(guī)格：10 mg/片)；鹽酸美金剛對照品(北京索萊寶科技有限公司，批號：109A022，純度≥98%)；三乙胺(上海阿拉丁試劑有限公司)、磷酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠)均為色譜純，其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.2 檢測條件

緩沖溶液：含有2%(體積分?jǐn)?shù))二甲基亞砜(DMSO)的3.0 mmol/L三乙胺-2.0 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 3.3)；進(jìn)樣時(shí)間：10 s；分離電壓：2.0 kV；根據(jù)前期工作[18]，非接觸電導(dǎo)檢測器的激發(fā)電壓：60 V，激發(fā)頻率：60 kHz。實(shí)驗(yàn)在恒溫(20 ℃)、恒濕(60%)條件下進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 儀器使用方法首先，使芯片上所有儲液池和通道充滿緩沖溶液，吸除樣品池中的緩沖溶液，在樣品池中加入樣品溶液。然后，在進(jìn)樣通道兩端加上進(jìn)樣電壓，進(jìn)行進(jìn)樣；進(jìn)樣完畢后，在分離通道兩端加上分離電壓，進(jìn)行分離。樣品通過檢測器被檢測，得到待測樣品的檢測分離圖譜。

1.3.2 供試品溶液的制備取鹽酸美金剛片20片在研缽中研細(xì)，精密稱取2.104 0 g(約含鹽酸美金剛100 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入緩沖溶液定容，超聲6 min后，得鹽酸美金剛質(zhì)量濃度約為2 mg/mL的供試品貯備液，于4 ℃下保存?zhèn)溆?，臨用前加入緩沖溶液稀釋至所需濃度。

1.3.3 對照品溶液的制備精密稱取鹽酸美金剛對照品0.020 0 g，置于10 mL容量瓶中，加入緩沖溶液溶解并定容，超聲6 min后，得鹽酸美金剛質(zhì)量濃度為2 mg/mL的對照品貯備液，于4 ℃下保存?zhèn)溆?，臨用前加入緩沖溶液稀釋至所需濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 DMSO體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

由于鹽酸美金剛在水中溶解度差，根據(jù)相似相溶原理，加入助溶劑DMSO改變?nèi)芤簶O性可增加鹽酸美金剛的溶解度。實(shí)驗(yàn)對DMSO的體積分?jǐn)?shù)(0.5%、1%、1.5%、2%、3%)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，2%的DMSO溶液可以完全溶解2 mg/mL鹽酸美金剛。因此，選擇DMSO的體積分?jǐn)?shù)為2%。

2.2 緩沖溶液種類的優(yōu)化

考察了對照品溶液(200 μg/mL)在含有2% DMSO的硼酸-硼砂、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸-組氨酸(MES-His)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸-三羥甲基氨基甲烷(MES-Tris)、Tris-磷酸、Tris-檸檬酸、Tris-硼酸、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、乙酸-乙酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、三乙胺-硼酸、三乙胺-磷酸等緩沖體系的出峰情況。結(jié)果顯示：在含2% DMSO的三乙胺-磷酸緩沖體系中鹽酸美金剛有峰響應(yīng)，且基線平穩(wěn),噪音低，峰形較好，出峰時(shí)間最短。在其他體系中不出峰，一方面可能與緩沖體系背景電導(dǎo)率與樣品解離的電導(dǎo)率相差不大有關(guān)，另一方面可能由于緩沖體系的pH值不適于樣品解離出峰。因此，選擇含有2% DMSO的三乙胺-磷酸作為緩沖溶液。

2.3 緩沖溶液濃度的優(yōu)化

考察了三乙胺-磷酸的濃度對鹽酸美金剛分離效果的影響，分別測試了含有2% DMSO的2.5 mmol/L三乙胺-2.5 mmol/L磷酸緩沖溶液、5.0 mmol/L三乙胺-5.0 mmol/L磷酸緩沖溶液、10.0 mmol/L三乙胺-10.0 mmol/L磷酸緩沖溶液、20.0 mmol/L三乙胺-20.0 mmol/L磷酸緩沖溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的增大，基線噪音也隨之增大，且鹽酸美金剛出峰不明顯，因此最終選擇緩沖對離子總濃度為5.0 mmol/L。

2.4 緩沖溶液pH值的優(yōu)化

考察了緩沖體系(均含2% DMSO)pH值對出峰的影響。如圖2所示，鹽酸美金剛在2.0 mmol/L三乙胺-3.0 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 2.9)中出峰情況較差，峰形為三峰；在2.5 mmol/L三乙胺-2.5 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 3.2)中的出峰情況稍有改善，但峰形為雙峰；在3.0 mmol/L三乙胺-2.0 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 3.3)中峰形良好，為單峰，且基線噪音較低；在4.0 mmol/L三乙胺-1.0 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.7)中的基線噪音低，但峰展寬，峰形較差。

上述結(jié)果表明，隨著pH值增加以及三乙胺濃度的增大，鹽酸美金剛的峰形由多峰變?yōu)閱畏?。但pH值過大、磷酸濃度過小會(huì)出現(xiàn)單峰峰展寬、出峰時(shí)間延后等現(xiàn)象，這可能與三乙胺-磷酸相對濃度改變導(dǎo)致緩沖溶液極性變化以及與緩沖溶液pH值有關(guān)。因此，最終選擇含2% DMSO的3.0 mmol/L三乙胺-2.0 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 3.3)作為運(yùn)行緩沖體系。

2.5 進(jìn)樣時(shí)間的優(yōu)化

考察了進(jìn)樣時(shí)間在5～20 s范圍內(nèi)對樣品分離和檢測的影響。結(jié)果顯示，隨著進(jìn)樣時(shí)間的延長，峰形及體系噪音等未發(fā)生明顯變化，而樣品由于進(jìn)樣時(shí)間增加，進(jìn)樣量增大，導(dǎo)致檢測峰信號的響應(yīng)值增大，但隨著進(jìn)樣時(shí)間的增加,峰展寬和峰形拖尾等影響變得顯著。綜合考慮，最終選擇進(jìn)樣時(shí)間為10 s。

2.6 分離電壓的優(yōu)化

考察了分離電壓在1.0～3.0 kV范圍內(nèi)對樣品分離和檢測的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較低的分離電壓會(huì)使樣品的出峰時(shí)間延長，且可能出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；而分離電壓過高時(shí)，電流增大，因焦耳熱效應(yīng)，基線噪音也隨之增加，導(dǎo)致信噪比下降。綜合考慮峰形、響應(yīng)值、噪音等因素，選擇最佳分離電壓為2.0 kV。

圖2 鹽酸美金剛在含2% DMSO的不同pH值的三乙胺-磷酸緩沖體系下的微流控芯片電泳色譜圖

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限按“1.3.3”方法配制質(zhì)量濃度分別為10、50、100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL的系列對照品溶液，按“1.2”條件進(jìn)行測定。以鹽酸美金剛的質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰高(y，mV)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得鹽酸美金剛的線性范圍為10～2 000 μg/mL，回歸方程為y=0.596 4x+52.68(r2=0.999 1)。分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)得到鹽酸美金剛的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)分別為7 μg/mL和10 μg/mL。

2.7.2 精密度實(shí)驗(yàn)取對照品貯備液適量，按“1.3.3”方法制備質(zhì)量濃度為100 μg/mL的對照品溶液。取上述溶液，按“1.2”條件重復(fù)進(jìn)樣測定6次，結(jié)果顯示鹽酸美金剛峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為1.3%，表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取樣品(批號:81216202)適量，按“1.3.2”方法制備質(zhì)量濃度為100 μg/mL的供試品溶液。分別于4 ℃下避光放置 0、2、4、8、12、24 h，按“1.2”條件進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示鹽酸美金剛峰高的RSD(n=6)為1.6%，表明供試品溶液在 4 ℃下放置 24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批次樣品(批號:81216202)適量，共6份，精密稱定，按“1.3.2”方法制備質(zhì)量濃度為100 μg/mL的供試品溶液。按“1.2”條件進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示鹽酸美金剛峰高的RSD(n=6)為1.8%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取樣品適量(批號:81216202)，共9份，分別置于10 mL容量瓶中，各加入低、中、高3個(gè)水平的對照品，按“1.3.2”方法制備供試品待測液，在“1.2”條件下進(jìn)樣測定，記錄峰高并計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，鹽酸美金剛的平均加標(biāo)回收率為96.5%～99.2%，RSD為3.0%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.8 樣品測定

取供試品貯備液1 mL，置于20 mL容量瓶中定容(約含鹽酸美金剛100 μg/mL)，按“1.2”條件進(jìn)樣測定，記錄電泳色譜圖與峰高，并計(jì)算鹽酸美金剛的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，3批次樣品測定的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.46%～103.27%，RSD為0.60%～2.1%，表明該方法在不同批次樣品測定中的重復(fù)性良好。鹽酸美金剛片供試品溶液的電泳色譜圖見圖3,鹽酸美金剛的保留時(shí)間低于18 s。

表2 樣品的測定結(jié)果(n=6)

圖3 供試品的微流控芯片電泳色譜圖

3 結(jié) 論

本文建立了微流控芯片非接觸電導(dǎo)法快速測定鹽酸美金剛片中鹽酸美金剛含量的方法。所建方法的線性范圍寬，檢測速度快，藥品及試劑消耗量少，成本低，操作簡便，可在18 s內(nèi)實(shí)現(xiàn)鹽酸美金剛片中鹽酸美金剛的快速測定，為鹽酸美金剛的現(xiàn)場質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供了參考。