柳訓才，張小江，張曉婷，徐敦明，范群艷*

( 1.燕之屋絲濃食品有限公司燕窩技術(shù)中心，福建 廈門 361100；2.廈門海關(guān)檢驗檢疫技術(shù)中心，福建 廈門 361026)

燕窩為雨燕科金絲燕舌下腺分泌的唾液凝結(jié)于懸崖、洞內(nèi)峭壁上或樓屋內(nèi)的橫梁上筑成的巢窩，主產(chǎn)于印度尼西亞、馬來西亞、泰國、越南等地[1-4]。其性平，味甘，有補肺養(yǎng)陰的作用，自古以來被視為一種食補極品、名貴藥材。其中表皮生長因子、唾液酸、人體必需氨基酸、礦質(zhì)元素、維生素B1、?；撬?、糖蛋白等成分的發(fā)現(xiàn)很好地詮釋了燕窩諸多的生物功效，如促進表皮生長、滋陰養(yǎng)肺、化痰止咳、抗氧化、抗病毒、延緩衰老、保護軟骨組織等[5-7]。

未經(jīng)燉煮的燕窩具有一種類似生蛋清的特殊氣味，研究構(gòu)成這種特殊性氣味的揮發(fā)性成分組成及含量變化對了解燕窩的氣味特征，探索燕窩品種/產(chǎn)地的鑒定、燕窩質(zhì)量的控制均具有十分重要的意義。但由于燕窩中揮發(fā)性成分含量低、易揮發(fā)、難萃取和濃縮，因此，有必要建立一種快速簡便的燕窩揮發(fā)性成分提取和檢測新技術(shù)。目前對于食品中揮發(fā)性成分的分析通常采用感官分析[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[10-12]、氣相色譜-嗅聞(Gas chromatography olfactometry,GC-O)[13-14]和電子鼻(Electronic nose,Enose)[15-17]等。其中，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用更能有效地對成分進行定性與定量分析。而固相微萃取(SPME)技術(shù)是一種集萃取、濃縮、進樣于一體的樣品前處理新方法，具有快速簡單、費用少、易于自動化、不需要溶劑等優(yōu)點[18]，已廣泛應(yīng)用于藥用[19]和香料植物[20]、茶葉[21]、肉類[22]和農(nóng)藥殘留量[23]檢測的樣品前處理，但尚未利用此項技術(shù)在燕窩中進行氣味研究。鑒于此，本文采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)探索燕窩中揮發(fā)性成分的參數(shù)條件，以期為燕窩的鑒定和質(zhì)量控制提供科學依據(jù)和實踐指導。

1 實驗部分

1.1 供試材料

產(chǎn)地為印尼的燕盞，由廈門燕之屋絲濃食品有限公司提供。

1.2 儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(島津公司，GCMS-TQ8040)，配石英毛細管色譜柱(Agilent公司，DB-5MS，30 m×0.25 mm，0.25 μm)；SPME手動進樣器及65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取頭(Supelco公司，57330-U和57320-U)；水浴鍋(群安實驗儀器有限公司，BHS-2)。

儀器參數(shù)：進樣口：溫度250 ℃，進樣時間2 min，不分流進樣，2 min開啟隔墊吹掃；程序升溫：初始溫度40 ℃，保留2 min,以10 ℃/min的速率升至260 ℃，保留6 min；載氣：He，流速：1.0 mL/min；接口溫度：260 ℃；電子轟擊離子源(EI)：230 ℃，電離能量：70 eV；質(zhì)譜模式：正離子，Q3 SCAN，離子掃描范圍(m/z)：45～400。

1.3 實驗方法

將燕盞粉碎成1 mm左右的顆粒，稱取6 g樣品于20 mL頂空瓶中，密封后將頂空瓶置于60 ℃水浴鍋中平衡20 min。再插入經(jīng)過熱清洗的65 μm PDMS/DVB萃取頭進行頂空萃取，繼續(xù)保溫60 min。保溫結(jié)束后立即將萃取頭插入GC-MS進樣口進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取頭的選擇

在相同的萃取及測定條件下，比較了100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(Carboxen/PDMS)、85 μm聚丙烯酸酯(Polyacrylate)4種萃取頭對揮發(fā)性成分的萃取效果，扣除掉樣品空白的背景峰后，4種萃取頭分別進樣測定總離子流圖(TIC)的峰數(shù)和總峰面積，結(jié)果見表1。

表1 4種萃取頭對燕窩中揮發(fā)性成分的吸附效果

根據(jù)SPME產(chǎn)品手冊說明，PDMS通常用于非極性揮發(fā)性化合物(MW 60～275)，Carboxen/PDMS用于氣體和低分子量化合物(MW 30～225)，Polyacrylate用于極性半揮發(fā)性化合物(MW 80～300)，而PDMS/DVB用于揮發(fā)性物質(zhì)、胺類、硝基芳香類化合物(MW 50～300)，其適用范圍更廣。表1的數(shù)據(jù)也證實了此結(jié)論，無論從峰數(shù)還是總峰面積，65 μm PDMS/DVB的萃取效果均強于其它3種萃取頭，另外3種萃取頭中，PDMS和Polyacrylate的總離子流圖的峰數(shù)相近，且優(yōu)于Carboxen/PDMS。此外，盡管萃取頭固定相的膜厚對萃取效果有重要影響，且較厚的膜更容易萃取高沸點化合物，但從表1可知，SPME固定相的極性比膜厚對萃取效率的影響更大。因此，實驗最終選擇65 μm的PDMS/DVB萃取頭對燕窩中的揮發(fā)性成分進行萃取。

圖1 萃取溫度對SPME萃取燕窩中揮發(fā)性成分的影響

2.2 萃取溫度的影響

為考察溫度對PDMS/DVB萃取效果的影響，實驗比較了萃取時間為30 min，溫度分別為40、50、60、70、80、90、100 ℃時，進樣測定總離子流圖(TIC)的出峰數(shù)和總峰面積(見圖1)。由圖1可見，隨著萃取溫度不斷的升高，可檢出萃取物的總峰數(shù)和總峰面積不斷增大。從圖2可觀察到，萃取溫度越高，絕大部分檢出物的含量均有提高，且保留時間大于15 min時含量提高程度更顯著。二圖均顯示，隨著萃取溫度的升高，燕窩中一些分子量大且較難揮發(fā)的物質(zhì)逐步從燕窩中釋放出來，且在100 ℃時仍呈上升趨勢?？紤]到后續(xù)將對SPME的測定數(shù)據(jù)與室溫下的感官嗅覺進行比較，本研究最終選擇60 ℃作為萃取溫度。

圖2 萃取溫度為60 ℃(黑)與80 ℃(紅)時燕窩中揮發(fā)性成分的TIC圖

圖3 萃取時間對SPME萃取燕窩中揮發(fā)性成分的影響

2.3 萃取時間的影響

為考察萃取時間對PDMS/DVB萃取效果的影響，實驗比較了60 ℃下萃取時間分別為10、20、30、40、50、60、80、100、120、150 min時的測定結(jié)果(見圖3)。結(jié)果顯示，隨著萃取時間的延長，萃取頭萃取的揮發(fā)性成分的總峰面積不斷升高，在60 min后變得平緩，120 min時接近平穩(wěn)，表明65 μm的PDMS/DVB萃取頭在120 min時達到吸附-解吸的平衡；進一步比較萃取時間為60 min和120 min時燕窩中揮發(fā)性成分的TIC圖(圖4)，發(fā)現(xiàn)隨著萃取時間的延長，總峰面積的增加來自于保留時間較長(沸點較高)的峰的貢獻。如保留時間為11.13 min的正壬醇，在60 min后已基本趨于飽和，而對于保留時間為17.85 min的1-十四碳醇，在120 min后峰面積仍有很大變動，相對于60 min處，其峰面積增加了約1/3。而峰數(shù)隨萃取時間的延長變化不大，在151～176 之間波動(平均值為164 個)，峰數(shù)的波動可能是由低含量的高沸點成分的色譜峰高在識別限值附近輕微波動，被積分參數(shù)中設(shè)置的閾值過濾掉所導致。鑒于萃取效率在60 min后逐漸趨于平緩，且所萃取的成分已具有一定代表性，因此選擇60 min作為本實驗的萃取溫度。

2.4 解吸時間的影響

比較了解吸時間分別為0.5、2、3、4、5 min時，TIC圖的總峰面積及峰數(shù)目。結(jié)果表明，不同解吸時間下，TIC圖中的峰面積在1.70×108～1.68×108，峰數(shù)在143～150 個之間波動，2 min即能夠?qū)PME中萃取的物質(zhì)完全解吸出來；繼續(xù)延長解吸時間,解吸效果差別不大。因此實驗選擇2 min作為最佳解吸時間(GC-MS進樣時間)

圖4 萃取時間為60 min(黑)與120 min(紅)時燕窩中揮發(fā)性成分的TIC圖

2.5 重復性實驗

為考察該測定方法的重復性，按照“1.3”進行燕窩樣品的處理和測定，連續(xù)平行測定6次，分別計算TIC圖中的峰數(shù)和總峰面積。結(jié)果顯示，連續(xù)平行測定6次，TIC圖中峰數(shù)值的相對標準偏差(RSD)為0.99%，總峰面積的RSD為0.62%。方法具有較好的重復性，可用于燕窩中揮發(fā)性成分的測定。但需指出的是，因SPME萃取頭的使用壽命較短(本實驗所用SPME萃取頭的使用參數(shù)為50～100 次)，在考慮方法的再現(xiàn)性時需對SPME的性能狀態(tài)予以重視。

2.6 成分分析

按照“1.3”進行燕窩樣品的處理，測定其揮發(fā)性成分(見圖5)，同時做樣品空白。將測定結(jié)果扣除樣品空白后，對色譜峰逐一以NIST 14與NIST 14s質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行檢索分析，并以峰面積歸一法確定組分中揮發(fā)性成分的相對含量(見表2)。結(jié)果顯示，燕窩氣味構(gòu)成復雜，其中以烴類(43種)、醇類(16種)、醛類(17種)、醚類(4種)、酯類(4種)為主，含量占比分別為39.29%、21.94%、17.77%、7.23%、4.06%，其余為酮類、酸類、酚類、噻唑類、吡喃類，共計82種，共同組成了燕窩的特殊氣味。

圖5 SPME/GC-MS測定時燕窩中揮發(fā)性成分的TIC圖

表2 燕窩中揮發(fā)性成分以NIST 14和NIST 14s進行檢索的結(jié)果

(續(xù)表2)

No.Retention time(min)CASComponentContent(%)Similarity(%)5515.8752425-77-61-Decanol,2-hexyl-(2-己基-1-癸醇)0.49895616.07013475-75-7Pentadecane,8-hexyl-(8-己基十五烷)0.62865716.28827538-41-611-Methyltricosane(11-甲基二十三烷)0.96885816.3644337-65-9Hexanedioic acid,mono(2-ethylhexyl)ester(己二酸1-(2-乙基己基)酯)2.24835916.525112-95-8Eicosane(正二十烷)1.13926016.6092882-96-4Pentadecane,3-methyl-(3-甲基十五烷)1.86936116.961629-94-7Heneicosane(正二十一烷)2.46966217.20325117-26-4Hexadecane,4-methyl-(4-甲基十六烷)0.10836317.3551560-89-0Heptadecane,2-methyl-(2-甲基十七烷)0.09806417.415119-61-9Benzophenone(二苯甲酮)0.46966517.5063892-00-0Pentadecane,2,6,10-trimethyl-(2,6,10-三甲基十五烷)1.23926617.54624851-98-7Cyclopentaneacetic acid,3-oxo-2-pentyl-,methyl ester(二氫茉莉酮酸甲酯)0.28826717.6631795-21-7Cyclopentane,decyl-(1-環(huán)戊基癸烷)0.93886817.6981561-02-02-Methylhexacosane(2-甲基二十六烷)0.45836917.851112-72-11-Tetradecanol(1-十四碳醇)0.76807017.9293075-84-11,1′-Biphenyl,2,2′,5,5′-tetramethyl-(2,2′,5,5′-四甲基聯(lián)苯)0.56837118.121629-78-7Heptadecane(正十七烷)1.03937218.1551921-70-6Pentadecane,2,6,10,14-tetramethyl-(2,6,10,14-四甲基-十五烷)0.73807318.29326627-85-0Hexacosanal(正二十六碳醛)0.32857418.75126429-11-8Heptadecane,4-methyl-(4-甲基十七烷)0.21837518.9066418-44-6Heptadecane,3-methyl-(3-甲基十七烷)0.33937619.447110-27-0Isopropyl myristate(十四酸異丙酯)0.03807719.6231120-36-11-Tetradecene(1-十四烯)0.14887819.7821222-05-5Cyclopenta[g]-2-benzopyran,1,3,4,6,7,8-hexahydro-4,6,6,7,8,8-hexamethyl-(佳樂麝香)0.05817920.05736653-82-41-Hexadecanol(1-十六碳醇)0.83978020.6725333-42-61-Dodecanol,2-octyl-(辛基十二烷醇)0.09908121.67018435-45-51-Nonadecene(1-十九碳烯)0.06908222.0682004-39-91-Heptacosanol(1-二十七碳醇)0.0794

3 結(jié) 論

本文建立了SPME/GC-MS 檢測燕窩中揮發(fā)性成分的分析方法，并對實驗條件進行了優(yōu)化。實驗結(jié)果顯示，以65 μm PDMS/DVB萃取頭在60 ℃下吸附60 min，解吸2 min后，采用GC-MS對燕窩樣品進行測定并輔以NIST 14和NIST 14s檢索，可獲得較好的分析結(jié)果，檢出醇、烴、醛、酯、醚類等化合物共82種。該方法具有吸附效果好，檢測靈敏度高，無需溶劑，直接進樣，且操作簡單快速的特點，因而是一種很有應(yīng)用前景的技術(shù)，有望廣泛用于燕窩揮發(fā)性成分的測定。