鄒家齊， 夏 云

腸球菌廣泛分布于自然環(huán)境、人和動物的消化道。作為一種機(jī)會性感染病原體，可引起菌血癥，心內(nèi)膜炎，腦膜炎，尿路、皮膚、軟組織和腹腔感染[1]。近年來，糞腸球菌已成為醫(yī)院感染的主要病原菌之一，其感染具有較高的發(fā)病率和病死率。由于糞腸球菌對頭孢菌素類、氨基糖苷類等常用抗菌藥物天然耐藥，臨床上用于治療腸球菌感染的抗菌藥物有限，而萬古霉素耐藥腸球菌（VRE）的出現(xiàn)進(jìn)一步增加了治療的難度[2-3]。利奈唑胺作為新一代唑烷酮類抗菌藥物，于2007年在中國正式上市，主要用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、VRE及其他耐藥革蘭陽性菌的感染。利奈唑胺通過與50S核糖體亞基單位結(jié)合抑制細(xì)菌的生長，干擾蛋白質(zhì)的合成，在體內(nèi)和體外均具有良好的抗菌活性[3]。近年來有關(guān)利奈唑胺耐藥糞腸球菌（LRE）的報道在世界各地出現(xiàn)，且多重耐藥菌株的流行仍使腸球菌感染的治療面臨挑戰(zhàn)。雖然利奈唑胺耐藥監(jiān)測結(jié)果報道世界范圍內(nèi)利奈唑胺耐藥率低于2%[4-6]，但重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耐藥監(jiān)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)LRE的分離率逐年上升，從2011年的0上升至2018年的6.8%。本研究探討我院臨床分離LRE耐藥機(jī)制，并分析LRE感染相關(guān)的危險因素，為流行病學(xué)研究和臨床感染控制和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2014年1月－2018年12月我院住院患者無菌體液標(biāo)本的非重復(fù)糞腸球菌1 902株。其中分離到85株LRE感染病例作為病例組，同時按照1∶1的比例隨機(jī)篩選出同期利奈唑胺敏感糞腸球菌（LSE）感染病例作為對照組。

1.2 儀器與試劑

PCR 擴(kuò)增儀（美國A B I 公司），VITEK 2-Compact全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司），凝膠成像儀（美國伯樂公司）。細(xì)菌DNA提取試劑盒（美吉生物公司），PCR反應(yīng)試劑盒（日本TaKaRa公司）。

1.3 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗

全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和配套的藥敏鑒定卡對病例組和對照組的所有菌株進(jìn)行15種常見抗菌藥物的藥敏檢測。利奈唑胺藥敏結(jié)果用微量肉湯稀釋法進(jìn)行確認(rèn)。判讀標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果解釋均參考2017年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）藥敏試驗指南[3]。質(zhì)控菌株為糞腸球菌ATCC 29212。

1.4 利奈唑胺耐藥基因的檢測

參照試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA。根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計引物[7-8]，包括23S rRNA V583 區(qū)片段，核糖體蛋白L3、L4，cfr、optrA和poxtA基因，PCR擴(kuò)增完成后將陽性樣本送生工生物公司測序，最后與ATCC 29212標(biāo)準(zhǔn)序列比對，optrA基因與糞腸球菌E349基因序列比對。

1.5 病例及臨床數(shù)據(jù)收集

所有患者臨床數(shù)據(jù)是從醫(yī)院信息系統(tǒng)（HIS）和實驗室信息系統(tǒng)（LIS）收集。LRE感染患者根據(jù)《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)（試行）》為診斷依據(jù)確認(rèn)醫(yī)院感染[9]。具體感染病種包括尿路感染、腹腔感染、切口感染、血流感染等，按照相關(guān)文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[10-13]。 統(tǒng)計以下參數(shù)，比較病例組和對照組的潛在危險因素：①人口統(tǒng)計學(xué)（年齡和性別）；②住院特征（外院轉(zhuǎn)來、外科病房、入住ICU）；③基礎(chǔ)疾病及并發(fā)癥（惡性腫瘤、肝膽疾病、冠心病、呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病、尿路感染、真菌感染、胃腸道疾病、高血壓、腎臟疾病、周圍血管疾病、低蛋白血癥、低鉀血癥和嚴(yán)重貧血）；④復(fù)數(shù)菌感染（定義為同一患者存在 ≥2種細(xì)菌感染）；⑤侵襲性操作[手術(shù)史（6個月內(nèi)）、氣管內(nèi)插管、中心靜脈導(dǎo)管、引流管、導(dǎo)尿管、鼻導(dǎo)管、胃管、膀胱灌洗、腸外營養(yǎng)]；⑥抗菌藥物使用情況（青霉素、氨基糖苷類、廣譜頭孢菌素、碳青霉烯類、氟喹諾酮類、糖肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、米諾環(huán)素等）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行所有數(shù)據(jù)分析。相關(guān)數(shù)據(jù)資料通過卡方檢驗或Fisher精確概率法進(jìn)行單因素分析，計算相關(guān)統(tǒng)計量用百分比（%）表示。單因素分析中P≤0.1的變量納入logistic回歸模型中，用于評估利奈唑胺耐藥的獨(dú)立危險因素。優(yōu)勢比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）以評估關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意 義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

收集的85例LRE感染患者中，尿路感染共29例（34.1%），15例患者近期（通常為 1 周）有內(nèi)鏡檢查或留置導(dǎo)尿管史提示無癥狀性菌尿，臨床表現(xiàn)尿急、尿頻、排尿困難提示可能為急性膀胱炎8例，伴有發(fā)熱、畏寒、腰脅部疼痛、腎區(qū)叩痛提示腎盂腎炎6例；手術(shù)切口感染23例（27.1%）；腹腔感染19例（22.4%）；血流感染2例（2.4%）等。標(biāo)本分布，85株LRE中，分離自尿液33株（38.8%），傷口分泌物16株（18.8%），引流液13株（15.3%），膽汁3株（3.5%）和血液2株（2.4%）等?？剖曳植迹改c外科17株（20.0%），婦科14株（16.5%），泌尿外科9株（10.6%），ICU 9株（10.6%）等。

2.2 藥敏情況

所有LRE菌株都處于低水平耐藥，MIC在8～16 mg/L。我院耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示LRE的分離率逐年上升，2011－2018年從0明顯增長到6.8%（見圖1），85株LRE對青霉素、四環(huán)素、紅霉素、左氧氟沙星、莫西沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為7.1%、96.5%、94.1%、68.2%、62.3%和69.4%，而對替加環(huán)素、哌拉西林和萬古霉素均敏感。有56株 （65.9%） 屬于多重耐藥菌株（對3類或3類以上抗菌藥物耐藥）。

圖1 2011－2018 LRE 檢出率動態(tài)變化Figure 1 Changing prevalence of linezolid-resistant Enterococcus faecalis （LRE） from 2011 to 2018

2.3 耐藥基因檢測結(jié)果

85株LRE中98.8%菌株攜帶optrA基因。L3核糖體蛋白的突變分析鑒定出S113L（n=4，4.7%）；L4核糖體蛋白突變31株，其中有T35A（n=9，10.6%）、I98V（n=2，2.4%）、N79D（n=2，2.4%）和Q103缺失（n=18，21.2%）；另外還發(fā)現(xiàn)了新的L4突變位點(diǎn)E120G （n=1，1.2%）。而在85株LRE菌株中未發(fā)現(xiàn)23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)突變和甲基轉(zhuǎn)移酶基因cfr和poxtA的存在。

2.4 LRE感染單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，外院轉(zhuǎn)入、高齡（≥60歲）、惡性腫瘤、血管疾病、氣管插管和三個月內(nèi)抗菌藥物暴露 （碳青霉烯類藥物）是LRE感染主要的危險因素（P均＜0.05）。見表1。

表1 LRE 感染危險因素的單因素分析Table 1 Univariate analysis of risk factors for linezolid-resistant Enterococcus faecalis infection

表1（續(xù)）Table 1（continued）

2.5 LRE感染多因素分析

多變量logistic回歸分析確定外院轉(zhuǎn)入、高齡（≥60歲）、惡性腫瘤、氣管插管以及碳青霉烯類和氟喹諾酮類的先前治療是LRE感染的獨(dú)立危險因素。見表2。logistic回歸模型的Hosmer-Lemeshow檢驗表明數(shù)據(jù)擬合良好（χ2=7.7，df=8，P=0.46）。

表2 LRE 感染危險因素的logistics 回歸多因素分析Table 2 Multivariate logistic regression analysis of risk factors for linezolid-resistant Enterococcus faecalis infection

3 討論

近年來對于LRE的報道在全球范圍內(nèi)逐年增多，2008－2016年美國SENTRY耐藥監(jiān)測項目發(fā)現(xiàn)LRE總體耐藥率0.38%[4]。而我院耐藥監(jiān)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)LRE的分離率逐年上升，從2011年的0上升至2018年的6.8%。與其他研究結(jié)果一致的是，在本研究中觀察到由介導(dǎo)唑烷酮類的耐藥基因optrA（98.8%）是利奈唑胺耐藥的主要機(jī)制，這表明optrA可能通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列等可移動元件進(jìn)行傳播的潛在風(fēng)險[14-15]。前期研究中，對LRE（P10748）、LSE （3138）和標(biāo)準(zhǔn)菌株糞腸球菌ATCC 29212進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序和蛋白組學(xué)測序，證實了由optrA基因編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATP binding cassette transporter）在糞腸球菌利奈唑胺耐藥中起重要作用[16-17]。在耐藥菌株中還發(fā)現(xiàn)與性信息素質(zhì)粒相關(guān)的Sea1、TraB蛋白高表達(dá)，故推測optrA介導(dǎo)的耐藥可由性信息素調(diào)控而進(jìn)行傳播。因此對于耐藥基因optrA的傳播機(jī)制有待進(jìn)一步研究。文獻(xiàn)報道利奈唑胺耐藥機(jī)制具有地區(qū)差異性，在其他地區(qū)23S rRNA V583突變是對利奈唑胺耐藥的主要機(jī)制[18]，因此分析本地區(qū)的耐藥機(jī)制對于流行病學(xué)研究具有較高的價值。

對LRE感染的危險因素進(jìn)行調(diào)查分析有助于預(yù)防感染，本研究發(fā)現(xiàn)與LSE組相比，LRE感染與從外院轉(zhuǎn)入獨(dú)立相關(guān)?？梢酝茰y外院轉(zhuǎn)入的患者可能由于復(fù)雜的病情和更嚴(yán)重的臨床癥狀而住院時間更長，并且這些患者中大多數(shù)可能具有更高接觸醫(yī)院病原體和接受抗生素治療的頻率[19]。老年人和患惡性腫瘤的患者由于免疫功能低下，感染LRE機(jī)會較大[20]。而氣管插管作為獨(dú)立危險因素的合理推測是氣管插管容易引起患者呼吸道黏膜損傷，機(jī)械刺激可導(dǎo)致防御屏障的損壞，從而降低防御效果，并且通過支氣管導(dǎo)管通路將病原體直接引導(dǎo)到體內(nèi)。這些患者的免疫功能狀態(tài)較差，導(dǎo)致感染發(fā)展的風(fēng)險也較高。

與LSE組相比，LRE感染的獲得與抗菌藥物先前使用有關(guān)，包括碳青霉烯類和氟喹諾酮類藥物?？赡艿慕忉屖菑V譜抗生素的治療可能導(dǎo)致胃腸道菌群紊亂，感染的機(jī)會就越大。另外，盡管有研究表明，細(xì)菌對利奈唑胺耐藥的產(chǎn)生與利奈唑胺長期暴露有關(guān)[21]。然而，在本院分離的85例LRE感染患者住院期間并沒有明確的利奈唑胺治療史，提示利奈唑胺暴露與其獲得性耐藥之間沒有明顯相關(guān)性[22]。綜上所述，本研究動態(tài)監(jiān)測到LRE分離率的明顯上升，并發(fā)現(xiàn)攜帶optrA基因為主要的耐藥機(jī)制。初步探究了我院LRE感染的臨床特征危險因素，發(fā)現(xiàn)從外院轉(zhuǎn)入、惡性腫瘤、氣管插管、碳青霉烯類和氟喹諾酮類抗菌藥物先前使用是導(dǎo)致LRE感染的獨(dú)立危險因素?？赏鄻颖镜亩嘀行难芯扛娼沂颈镜貐^(qū)LRE耐藥機(jī)制及感染的危險因素。