陳勝杰，高翔，袁戎宇

(廣東怡和科潔科技有限公司，廣東 佛山， 528000)

釀酒酵母是一種單細(xì)胞真菌，能將糖發(fā)酵成酒精和CO2，分布于整個自然界，是一種典型的兼性厭氧微生物，是一種天然發(fā)酵劑[1]。玉米秸稈含有豐富的纖維質(zhì)原料及可利用的化學(xué)成分，含有30%以上的碳水化合物、2%～4%的蛋白質(zhì)和0.5%～1%的脂肪，秸稈是一種具有多用途的可再生的生物資源[2]。每年有50%以上的玉米秸稈被農(nóng)民焚燒，既浪費資源，又污染了環(huán)境。玉米秸稈可經(jīng)過水解處理后，可釋放豐富的發(fā)酵型降解寡糖和單糖，作為二代燃料乙醇的重點研發(fā)原料，具有巨大的市場和政策紅利[3]。

經(jīng)典的玉米秸稈處理方法是先經(jīng)稀酸高溫預(yù)處理，然后投放水解酶水解得到水解液，其中含有較多的副產(chǎn)物，如糠醛、乙酸[4]等，使其后期的微生物發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)節(jié)受到影響，菌株發(fā)酵效率降低[5]。為了解決此類問題，研究者提出了許多改進(jìn)措施，如陳尚妍等[6]通過增加預(yù)處理時秸稈干物料比重，增加處理效率；朱艷等[7]通過減少稀硫酸的濃度，提高預(yù)處理溫度同時縮短預(yù)處理時間，避免副產(chǎn)物的過多產(chǎn)生；李小娟等[8]通過誘變及馴化等手段提高工程菌對糠醛、乙酸的耐受力，從而減少抑制物對發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

本文主要以超酒酵母xp為出發(fā)菌，通過采用常溫常壓等離子誘變技術(shù)(atmospheric and room-temperature plasma mutagensis，ARTP)獲得突變體庫，并以含有定量抑制物糠醛和乙酸的YPD培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，通過多代馴化，逐步增加培養(yǎng)基中抑制物濃度，最終達(dá)到和玉米秸稈水解液中抑制物濃度相同水平，篩選出能適應(yīng)玉米秸稈水解液中副產(chǎn)物濃度的釀酒酵母。相比于傳統(tǒng)誘變方法，利用ARTP有效造成種類豐富的DNA損傷，突變庫容量大且正突變率高，且ARTP 誘變育種技術(shù)操作簡便、安全無毒[9]。本實驗結(jié)果將為后續(xù)的規(guī)模應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

YPD液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，固體培養(yǎng)基需另加2%瓊脂，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

玉米秸稈水解液，來自我司水解產(chǎn)物，經(jīng)檢測，內(nèi)含主要可發(fā)酵性糖類(g/L)為：葡萄糖60，木糖20；主要抑制物濃度(g/L)為：糠醛3.78，乙酸1.6。玉米秸稈，網(wǎng)購自山東聊城。

初篩抑制培養(yǎng)基(g/L)：50%玉米秸稈水解液的抑制物濃度，即含有糠醛1.85、乙酸0.8的YPD瓊脂培養(yǎng)基。

釀酒酵母xp，本實驗室菌種保藏室提供。其他試劑，均購自市售門店。

1.2 儀器與設(shè)備

ARTP生物誘變儀，北京思清源生物科技有限公司；Biorad Aminex HPX-87H 有機(jī)酸分析柱和C18柱，美國菲羅門公司；恒溫?fù)u床，天津歐諾儀器儀表有限公司；SW-CJ型潔凈工作臺，蘇州安泰；752型分光光度計，上海菁華科技；高效液相色譜儀，美國安捷倫；生化培養(yǎng)箱，廣東醫(yī)療器械廠；微量移液器，美國Effendorf；96孔板酶標(biāo)儀，美國Biotek Epoch；SBA-40E生物傳感儀，山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 突變體庫的建立

采用ARTP技術(shù)獲得突變體庫，條件為：在 15 W紫外燈下，距離30 cm 照射85 s，致死率在92%左右，得到的菌株突變體庫性能優(yōu)良，突變率高[10]。

1.3.2 初篩培養(yǎng)

以初篩培養(yǎng)基對ARTP突變體庫進(jìn)行初篩，挑選長勢好、大小適中的單菌落。

1.3.3 馴化條件及改造菌的獲得

共計挑選96株單菌落，于96孔板上培養(yǎng)，初代培養(yǎng)液為液體初篩培養(yǎng)基，每孔裝液量100 μL， pH 6.0，培養(yǎng)溫度32 ℃，24 h后得到一代種子液；

按5%的接種量將一代種子液轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，得到二代。并重復(fù)培養(yǎng)至第25代種子液；每轉(zhuǎn)接一代，培養(yǎng)液中的糠醛濃度增加0.076 g/L，乙酸濃度增加0.032 g/L，依次遞增。并在100%的玉米水解液中轉(zhuǎn)接3代，得到穩(wěn)定的馴化菌。用96孔板酶標(biāo)儀測量96株馴化菌的OD600值，挑選生物量較高的5株菌，分別記作xp1、xp2、xp3、 xp4、xp5。

1.3.4 改造菌生物學(xué)性能檢測

生長曲線以細(xì)胞干重為準(zhǔn)，采用752型分光光度計檢測菌體OD600值，根據(jù)公式換算得到。在不含抑制劑的YPD液體培養(yǎng)基中，分別對5株突變馴化菌和原始菌進(jìn)行培養(yǎng)，每2 h取樣檢測生物量，并繪制生長曲線；葡萄糖濃度檢測采用SBA-40E生物傳感儀檢測。

以下成分均用高效液相色譜法進(jìn)行，且均采用外標(biāo)法和峰面積積分法測定。乙醇檢測條件如下：Biorad Aminex HPX-87H 色譜柱，柱溫50℃，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，RID檢測器35℃[11]；糠醛的檢測條件為：C18柱，流動相為V(乙睛)/V()0.1%乙酸)=10∶90，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，波長277 nm[12]；乙酸的檢測條件為：Biorad Aminex HPX-87H 色譜柱，柱溫30 ℃，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，紫外檢測波長215 nm，采用二元梯度分析[13]；木糖的檢測條件為：采用Biorad Aminex HPX-87H 色譜柱，柱溫55 ℃，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，RID檢測器溫度35 ℃[14]。

得到各成分濃度后，換算相應(yīng)的指標(biāo)，具體如下：

糖醇轉(zhuǎn)化率YE/S(g/g)=乙醇max/耗糖量；乙醇平均得率Q(g/(L·h))=乙醇max/發(fā)酵時間；ΔYE/S/%=(YE/S-xpi/YE/S-原菌)×100；ΔQ/%=(Qxpi/Q原菌)×100；ΔDCW/%(DCW-xpi/ DCW-原菌)×100[15]；菌體生長曲線時均采用菌體干重數(shù)值，對應(yīng)關(guān)系為：DCW=0.260 2×OD600+0.658 8，R2=0.990 7。其中， xpi指各改造菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 馴化菌的生長曲線

由圖1可知，5株改造菌進(jìn)入對數(shù)期和平穩(wěn)期的時間更快，在6 h左右擺脫延遲期進(jìn)入對數(shù)期，22 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，比原菌分別提早10 h和16 h(原菌14 h左右進(jìn)入對數(shù)期，38 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期)，且改造菌穩(wěn)定期持續(xù)時間為20 h，比原菌增加了4 h。另外，在菌體生物量方面，進(jìn)入穩(wěn)定期后，xp1、xp2、xp4的菌體數(shù)均高于原菌， xp5菌體數(shù)與原菌基本持平，xp3菌體略低于原菌，其中xp2的DCW值為最高的3.71，比原菌的3.12提高了18.9%。

圖1 各菌株生長曲線圖Fig.1 Growth curve of each strains

2.2 改造菌發(fā)酵上清液的各項成分檢測

結(jié)合之前測菌體生長曲線的數(shù)據(jù)，將各菌株的發(fā)酵時間調(diào)整到48 h，培養(yǎng)基為100%的玉米秸稈水解液，發(fā)酵結(jié)束后離心得到上清液，并檢測各成分含量，具體結(jié)果見表1。

表1 發(fā)酵過程中各成分質(zhì)量濃度 單位：g/L

由表1可知，5株改造菌的葡萄糖均在32 h左右耗盡，并且少量消耗木糖，其中xp2的木糖消耗最多，僅6.5 g。說明改造菌的碳源喜好與原菌相差不大，均優(yōu)先利用葡萄糖作為碳源。改造菌的葡萄糖消耗速率明顯快于原菌(見圖2-a)，說明改造菌的糖轉(zhuǎn)運和消化系統(tǒng)得到顯著提升。5株改造菌的最高乙醇濃度表現(xiàn)各有不同，其中xp2濃度最高，為38.7 g/L，乙醇濃度增高的有xp2、xp3和xp5，三者在抗抑制物方面也表現(xiàn)出了較好的抗性，均能更好轉(zhuǎn)化和降低主要副產(chǎn)物糠醛和乙酸等(見圖3)，這也是改造菌能更快的生長的因素之一。

由圖3可知，發(fā)酵結(jié)束時，各改造菌的上清液中糠醛和乙酸等副產(chǎn)物濃度均有不同程度的減少，證明改造菌對抑制物的降解轉(zhuǎn)運能力有所提升，抵抗能力增強。其中，xp2菌株的糠醛殘留量為1.43 g/L，相比出發(fā)菌降低了62.17%，乙酸殘留1.21 g/L，相比出發(fā)菌降低了26.67 %

2.3 改造菌各參數(shù)指標(biāo)的變化

由表2和圖4可知，5株改造菌的發(fā)酵參數(shù)指標(biāo)相比原菌均有不同程度的變化，其中xp2菌株的各項參數(shù)均有提升，乙醇平均得率相比原菌提高了27.7%。糖醇轉(zhuǎn)化率方面，xp2和xp5均有不錯的提升，相對原菌分別提高了17.1%和6.44%；細(xì)胞干重方面除了xp3菌株外，其他4株菌有不同程度的提升，菌株生長能力是后續(xù)乙醇積累的前提，足量的活菌更能實現(xiàn)乙醇的有效積累。

3 討論

本文旨在通過ARTP誘變技術(shù)聯(lián)合玉米秸稈水解液馴化方式，得到能夠適應(yīng)玉米秸稈水解液環(huán)境的

a-過程中葡萄糖濃度變化曲線;b-過程中木糖濃度變化曲線;c-過程中乙醇濃度變化曲線圖2 發(fā)酵過程中的木糖、葡萄糖和乙醇的濃度變化Fig.2 Changes in the concentration of ethanol, xylose and glucose during fermentation

圖3 發(fā)酵結(jié)束時上清液中糠醛和乙酸等副產(chǎn)物的濃度Fig.3 Concentration of byproducts such as furfural and acetic acid in the upper liquid at the end of fermentation

表2 改造菌發(fā)酵結(jié)束后各參數(shù)指標(biāo)的變化Table 2 Changes of parameters of modified strains after fermentation

圖4 改造菌的各參數(shù)值相對于原菌的變化情況Fig.4 Changes of parameters of modified strains after fermentation

改造菌株，提高菌株性能。本實驗得到了最優(yōu)表現(xiàn)型菌株xp2，株挑選菌中有2株在糖醇轉(zhuǎn)化率、乙醇平均得率和生物量方面均高于原菌，其正向突變率接近40%左右。其中，xp2的生長速率較原始菌有明顯提高，22 h進(jìn)入穩(wěn)定期，比原菌(36 h)縮短到了14 h，縮減比例達(dá)到了38.89%。并且在此基礎(chǔ)上細(xì)胞干重也較原菌提高了19.68%，乙醇平均得率提高了27.7%，糖醇轉(zhuǎn)化率提高了17.1%。葡糖糖和木糖的消耗量和利用效率也有顯著提高，且改造菌對糠醛轉(zhuǎn)化能力明顯提高，對乙酸的轉(zhuǎn)化能力也有一定程度的提升。其中，乙醇平均收率高達(dá)0.806 g/(L·h)，與ZHANG等[16]報道的效率基本持平(其發(fā)酵周期為96 h)。通常酵母菌培養(yǎng)周期在2～7 d[17]，此次改造菌的生長速率提升，將有效縮短生長周期，提高生產(chǎn)效率，降低成本。ARTP技術(shù)能高效突變原始菌，使其發(fā)生不定項突變，獲得優(yōu)質(zhì)的突變體庫，然后通過進(jìn)一步的馴化，提高其轉(zhuǎn)化降解抑制物，諸如糠醛，香草醛等的能力，達(dá)到抗抑制的目的。

本實驗仍有需要完善之處，如玉米秸稈的預(yù)處理方式對水解液的副產(chǎn)物成分有直接的影響作用，后期可以更多的在優(yōu)化預(yù)處理方式方面尋找突破口，如采用熱水預(yù)處理[18]，蒸汽暴破法[19]，超臨界CO2萃取法[20]等手段降低副產(chǎn)物的形成；另外，改造菌對糠醛的轉(zhuǎn)化雖然有一定提高，但發(fā)酵上清液中殘留的糠醛濃度仍較高(1.43 g/L)，其對菌體的毒害作用仍不容忽視，同樣的情況也表現(xiàn)在乙酸的轉(zhuǎn)化方面，改造菌對乙酸的消耗基本忽略不計，加上發(fā)酵過程菌株自身代謝產(chǎn)生的乙酸，其毒害抑制作用仍存在。

4 結(jié)論

本文以超酒酵母xp為出發(fā)菌株，通過常溫等離子誘變(ARTP)技術(shù)，得到突變體庫，并以玉米秸稈水解液為篩選壓力，經(jīng)過多代連續(xù)傳代，梯度增加抑制物濃度，馴化培養(yǎng)突變株，最終篩選出能夠在玉米秸稈水解液中高產(chǎn)酒精的改造菌xp2，其菌體生物量DCW最高為3.71 g/L，較原菌的3.10 g/L上升了19.68%，生長對數(shù)期為6～22 h，穩(wěn)定期為22～42 h，比原菌的對數(shù)期明顯提前，穩(wěn)定期持續(xù)時間延長4 h，生長性能優(yōu)勢明顯；發(fā)酵上清液中的糠醛1.43 g/L，乙酸1.21 g/L，較出發(fā)菌株發(fā)酵上清液的糠醛3.78 g/L，乙酸1.65 g/L，分別降低了62.17%和26.67%，表明改造菌轉(zhuǎn)化糠醛和乙酸的能力較原菌有明顯提升；乙醇收率和平均得率分別為38.7 g/L和0.806 g/(L·h)，較出發(fā)菌株分別提高了17.72%和27.71%。本實驗篩選得到的xp2菌株具備一定的工業(yè)應(yīng)用價值，對后續(xù)的研究提供一定的借鑒意義。