朱健偉 駱 丹

1浙江醫(yī)院皮膚科，浙江杭州，310013；2南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇南京，210029

正常人表皮角質形成細胞(KC)能低水平表達CD40、CD54以及MHC-II等重要的表面抗原，其中以CD40的炎癥介導作用較為突出[1,2]。在皮膚炎癥(如銀屑病、特應性皮炎等)病理條件下，KC表面的CD40分子能被多種炎癥因子如IFN-γ、IL-6、TNF-α等不同程度地上調，并與其趨化到表皮的T細胞表面的天然配體gp39相作用，加強KC炎癥介質如IL-8、RANTES、MCP-1的釋放和表面抗原CD54等的表達，進一步擴大炎癥反應，即所謂的CD40/gp39途徑[2]。以銀屑病為例，CD40在銀屑病皮損中顯著表達，伴大量T細胞浸潤，用CTLA4 Ig阻斷T細胞的共刺激能逆轉銀屑病皮損中KC和內皮細胞的病理狀態(tài)，使病情得到臨床改善，并在連續(xù)性標本中見到CD40等表面抗原的表達顯著下降[2,3]。此外，KC尚能自分泌具有較強免疫抑制作用的神經肽α-MSH，而UVB能誘導KC分泌α-MSH[4]。為進一步明確CD40是否參與介導KC的炎癥反應，部分闡明UVB治療炎癥性皮膚病的可能機制，本研究以IFN-γ刺激KC，模擬炎癥狀態(tài)下KC的微環(huán)境，觀察UVB對該環(huán)境下KC形態(tài)、活性、表面抗原CD40、CD54、MHC-II及炎癥因子IL-8、IL-6、TNF-α表達的影響，并探討UVB對KC產生α-MSH的時效性影響。

1 材料和方法

1.1 材料 二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶、分離酶、臺式UVB照射儀均為美國Sigma公司產品。角質形成細胞無血清培養(yǎng)基(KC-SFM)購自美國Gibco公司。25 cm2塑料培養(yǎng)瓶、6孔和96孔培養(yǎng)板為美國Corning公司產品。噻唑藍(MTT)為美國Amersco公司產品。FITC標記鼠抗人CD40、CD54、MHC-II等抗體、IL-8、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司。α-MSH放免試劑盒購自瑞典Euro-Diagostica公司。重組人IFN-γ和可溶性CD40配體(sCD40L)均購自英國Peprotech公司。Clinibio128c酶聯(lián)免疫檢測儀系澳大利亞Clinibio公司產品。FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司。DFM-96型16管放免γ計數器為眾成公司產品。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取環(huán)切術后正常青少年包皮1塊，碘伏浸泡5 min后PBS清洗，剪除皮下組織，然后把皮片剪成1 cm2的皮片置入含0.5%分離酶的PBS中4℃消化12～16 h，眼科剪小心分離表皮，采用0.25%胰酶(含EDTA 0.53 mmol/L)37℃消化表皮5～10 min，吸去胰酶，加入含10%小牛血清培養(yǎng)基終止消化，反復吹打，離心1000轉10 min后棄上清，再用培養(yǎng)基吹懸細胞，以1×106個/cm2細胞密度接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基為含50 mg/L BPE、5 μg/L EGF、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的角質形成細胞無血清培養(yǎng)基(KC-SFM)，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)20 h后更換新鮮培養(yǎng)基，去除未貼壁細胞。以后每3天換液1次，細胞傳至3代用于實驗。

1.2.2 實驗分組 我們用多個濃度的IFN-γ(50, 100, 200, 300, 500, 1000 IU/mL)處理KC，并在不同時間點進行觀察和標本收集，發(fā)現(xiàn)300 IU/mL的IFN-γ對KC的刺激作用較強，且無明顯毒性，在作用72 h后刺激作用最佳；更高濃度的IFN-γ則對KC產生明顯毒性，表現(xiàn)為增殖抑制，細胞凋亡增加。因此，我們選擇了300 IU/mL的IFN-γ作為最終實驗濃度。然后，將細胞以105個/cm2的密度接種于6孔板，待其生長貼壁并融合至80%后，分為空白組、300 IU/mL IFN-γ 處理72 h組、300 IU/mL IFN-γ處理72 h后再加100 ng/mL sCD40L孵育48 h組3組，每組重復3次，IFN-γ和sCD40L劑量及處理時間的設計參考文獻[5]。然后在以上分組的基礎上再分設照光組和非照光組，照光組以30 mJ/cm2的生理劑量UVB進行照射，以模擬表皮對UVB的反應[6]。第3組的照光組在照光結束24 h后再加入sCD40L孵育。

1.2.3 KC的形態(tài)學觀察 用倒置光學顯微鏡(奧林巴斯，CH型)觀察IFN-γ處理72 h前后細胞形態(tài)學的變化，以及IFN-γ處理后再用30 mJ/cm2UVB照射后細胞形態(tài)學的改變。

1.2.4 細胞活性的測定 采用MTT法，將細胞按空白組、300 IU/mL IFN-γ處理72 h組、30 mJ/cm2UVB組、300 IU/mL IFN-γ 處理72 h+30 mJ/cm2UVB組接種于96孔板，第3、4兩組均在照光后24 h進行測定。每組設8個復孔。待細胞貼壁后，按上述分組對細胞進行處理，然后每孔(含100 mL培養(yǎng)基)加入20 mL濃度為5 mg/mL的MTT，孵育4 h，棄去上清，加入等量二甲基亞砜(DMSO)溶解，室溫下振蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm處吸光值(A值)。

1.2.5 KC表面抗原的測定 用0.25%胰酶消化和收集未照光及照光24、48、72 h后的細胞于1 mL的EP管中，用PBS洗滌2次，離心棄上清液，每管加入FITC標記的CD40單抗10 μL，重復的兩組細胞分別加入CD54和MHC-II單抗各10 μL，常溫避光作用20 min，然后再用PBS洗滌3次，離心后加入250 μL含1.5%多聚甲醛的PBS，4℃固定15 min，混勻后進行流式細胞術測定。加有sCD40L孵育的各組只測CD54和MHC-II。

1.2.6 上清液中α-MSH濃度的測定 采用放射免疫法(RIA)，樣本不與ACTH、β-MSH及γ-MSH交叉。樣本分空白組、300 IU/mL IFN-γ組及30 mJ/cm2UVB等3組，分別在0、24、48、72和96 h提取上清。檢測時，首先配備α-MSH標準品，濃度按說明書。吸取各濃度標準品、樣本及對照各100 μL加入塑料離心管(NSB管的標準品濃度為0)，然后加200 μL抗α-MSH抗體于所有管中(NSB和TOT管除外)，同時加200 μL稀釋液于NSB管中，旋渦混合后4℃存放24 h。各管加入200 μL 125I-α-MSH，再次旋渦混勻后4℃存放24 h。加500 μL的二抗-PEG于除TOT管的所有管中，旋渦后4℃反應45 min，離心棄上清，在γ臺檢測沉淀物的放射活性。

1.2.7 上清液中IL-6、IL-8、TNF-α濃度的測定 收集各實驗組細胞上清液，按照ELISA說明書嚴格操作，測定上清液中IL-6、IL-8、TNF-α的含量。

1.2.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行t檢驗和方差分析。

2 結果

2.1 KC的形態(tài)學觀察 細胞呈鵝卵石狀，表面光滑，少數細胞可見微小突起。IFN-γ處理72 h后，細胞密度增高，大部分細胞表面可出現(xiàn)微小突起。棄去含IFN-γ的培養(yǎng)基，再用30 mJ/cm2UVB處理該細胞24 h后發(fā)現(xiàn)，細胞逐漸恢復初始形態(tài)，細胞密度降低(圖1)。

圖11a:為正常人角質形成細胞形態(tài)；1b:為IFN-γ刺激72 h后的角質形成細胞形態(tài)；1c:為IFN-γ刺激72 h后再用30 mJ/cm2UVB處理24 h后的角質形成細胞形態(tài)

2.2 MTT測定結果 單用IFN-γ處理KC 72 h后，其活性較對照組明顯增強(P<0.05)；30 mJ/cm2UVB處理細胞24 h后，細胞活性較空白對照組略低；而IFN-γ處理72 h再用UVB處理細胞24 h后，發(fā)現(xiàn)細胞活性急劇下降，A值從4.02降至1.31，差異具統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 各處理組的角質形成細胞活性(MTT法)

2.3 KC表面抗原測定結果 各處理組KC表面抗原的表達情況見表1。對照組細胞CD40的表達率為(7.68±2.14)%，即KC表面有少量CD40的表達。經IFN-γ刺激72 h后，其表達率顯著提高(P<0.01)，為(91.36±2.92)%。IFN-γ刺激后的細胞再經30 mJ/cm2UVB照射后，其CD40表達率逐漸下降(圖3a)，至72 h為(30.84±3.36)%。另外，同時可測得正常細胞CD54表達率為(4.45±0.61)%，IFN-γ刺激72 h后其表達率為(12.07±0.87)%,當IFN-γ刺激72 h再加入sCD40L后，CD54的表達率進一步增高，為(80.47±6.11)%，而IFN-γ刺激72 h后的細胞加用30 mJ/cm2UVB處理24 h后，再加sCD40L孵育48 h，發(fā)現(xiàn)CD54的表達率雖仍高于對照組和未經sCD40L配基化的IFN-γ處理組，但較未照光的IFN-γ處理組大為下降(圖3b)。加入sCD40L后，細胞表面CD54的表達上調具有CD40特異性，它能被sCD40L特異性抗體所阻斷。IFN-γ還能上調KC表面MHC-II分子的表達，UVB亦能下調IFN-γ誘導的MHC-II分子的表達，但加入sCD40L后其表達無明顯變化。

表1 各處理組KC 3種表面分子的表達情況

注:N表示未檢測。與對照組相比, 1)P<0.01;2)P<0.05。涉及UVB組均在照射后72 h后檢測

2.4 上清液中α-MSH測定結果 各組上清液中α-MSH的測定結果見圖4?？梢姡琄C能低水平分泌α-MSH，經UVB照射后，其分泌量在24 h內升高，48 h時差異具統(tǒng)計學意義(P<0.05)，72 h達高峰(P<0.01)，96 h后驟降為基礎水平。IFN-γ不影響α-MSH的表達(P>0.05)。

2.5 上清液中細胞因子測定結果 IFN-γ刺激后的KC與sCD40L孵育48 h后，IL-8的釋放量最高(P<0.01)。而IFN-γ刺激后的KC用UVB照射后再與sCD40L孵育，IL-8的分泌量大為下降(P<0.05)。而TNF-α、IL-6的濃度無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 各處理組KC IL-8、TNF-α及IL-6的分泌情況

注:與對照組相比, 1)P<0.01;2)P<0.05。涉及UVB組均在照射后72 h后檢測

圖3各處理組細胞表面CD40、CD54的流式測定結果 3a：峰1示對照組CD40表達,峰2示IFN-γ處理72 h后的CD40表達，峰3示IFN-γ處理后再用30 mJ/cm2UVB 照射后72 h的CD40表達；3b：峰1示對照組CD54表達，峰2示IFN-γ 72 h+sCD40L 48 h 后的CD54 表達，峰3示IFN-γ 72 h+UVB 24 h+sCD40L 48 h后的CD54表達圖4各處理組α-MSH濃度變化

3 討論

在多種免疫性皮膚病，T細胞和KC處于激活狀態(tài)。激活狀態(tài)下的KC表面CD40分子和T細胞表面的gp39相結合被認為參與了這類皮膚病的發(fā)病。Pasch等[2]采用免疫組化檢測了銀屑病患者皮損和非皮損部位CD40和gp39的分布。結果顯示，皮損和非皮損部位均有CD40+的KC集落。在皮損處可見大量T細胞，gp39+T細胞可見于70%的皮損中，而在非皮損部位，gp39+T細胞只占20%。他們還發(fā)現(xiàn)，經IFN-γ處理的KC能釋放少量IL-8、RANTES及MCP-1，用可溶性gp39與CD40結合后能大大加強其釋放。在特應性皮炎患者，樹突狀細胞(DCs)表面的CD40配體很可能就是與KC表面的CD40相結合，致使炎癥的持續(xù)發(fā)生[7,8]。在接觸性超敏反應中，KC表面CD40分子的專一性結合加劇和延長了皮膚免疫反應，CD40分子能在體內放大皮膚和區(qū)域T細胞應答[9]。以上均說明CD40/gp39是炎癥啟動的重要途徑。

本研究證實，正常人KC能低水平表達CD40、CD54、MHC-II分子，IFN-γ能增強KC的活性，并加強其表面這3種抗原的表達，30 mJ/cm2UVB照射對NHK的形態(tài)、活性及其表面抗原的表達無明顯影響，但能抑制IFN-γ誘導的細胞增殖和活性的增強及其表面抗原的過表達，該抑制效應在照射后72 h達高峰。我們還發(fā)現(xiàn)，CD54的表達確實具有CD40特異性，因為加入sCD40L孵育后，CD54的表達進一步升高，而MHC-II沒有出現(xiàn)這一情況，這說明CD54的過表達主要是通過CD40/gp39途徑所介導。此外，我們定量測得UVB照射能促進KC自分泌產生一種具有免疫抑制作用的神經肽α-MSH，其分泌具有一定時間依賴，在UVB照后24 h開始升高，72 h達高峰，96 h驟降為基礎水平。細察可發(fā)現(xiàn)，α-MSH分泌水平與細胞表面CD40表達率剛好呈相反趨勢，在UVB照后72 h，α-MSH分泌量達高峰的同時，細胞表面CD40的表達率達最低。因此，我們推測UVB很可能是通過誘導KC產生α-MSH，間接地下調了炎癥因子誘導的細胞表面CD40等分子的表達，從而干預了CD40/gp39途徑對炎癥的啟動。另外，表1、2的結果還證實CD54的高表達及IL-8的大量釋放促使了炎癥反應的持續(xù)發(fā)生，這種情況至少部分由CD40/gp39途徑啟動，因此，只要細胞處于CD40/gp39激活狀態(tài)，UVB就能抑制該途徑而降低皮損中CD54和IL-8的表達水平。此外，UVB能加強KC IL-8的產生，其實這種產量與前者相比是微乎其微而且是暫時性的。

總之，在一些免疫性皮膚病的炎癥反應中，多種炎癥細胞因子(如IL、IFN、TNF等)能上調KC表面CD40的表達，同時趨化T細胞和DCs聚集并使其表達CD40配體即gp39，致使CD40/gp39相互作用，引起一系列免疫應答。UVB照射能下調炎癥細胞因子誘導的CD40的表達，是CD40/gp39途徑的一項重要干預手段。