曾婷婷 謝芝勛 謝麗基 謝志勤 張艷芳 黃嬌玲張民秀 范 晴 羅思思 王 盛

廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，南寧530001

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）強(qiáng)毒株感染引起的一種烈性傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的必須通報(bào)的疫病之一。NDV 宿主范圍廣泛，目前發(fā)現(xiàn)超過250 種禽類可以感染NDV。在世界范圍內(nèi)已發(fā)生過4 次大規(guī)模的新城疫暴發(fā)，每次都伴隨著新的基因型和新的感染宿主出現(xiàn)。因此，對NDV流行毒株進(jìn)行病原學(xué)監(jiān)測和分子流行病學(xué)信息跟蹤是防控NDV 的重要內(nèi)容。為了解NDV 在活禽市場的雞群中的感染情況，2018 年本實(shí)驗(yàn)室從廣西境內(nèi)10 個活禽市場采集雞咽喉和泄殖腔拭子共705份，進(jìn)行病毒分離鑒定，并擴(kuò)增和分析13 份HI 試驗(yàn)陽性樣品的NDVF基因，旨在為雞NDV 的流行病學(xué)提供研究材料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.2 方 法

病毒分離方法和基因擴(kuò)增、克隆、測序參考謝麗基等[1]。設(shè)計(jì)4 對引物擴(kuò)增NDVF基因，F(xiàn)GENE 1 和FGENE 2 擴(kuò)增產(chǎn)物拼接可得到NDV CLASS ⅠF基因全長，F(xiàn)GENE 3 和FGENE 4 擴(kuò)增產(chǎn)物拼接可得到NDV CLASS ⅡF基因全長（引物見表1）。

1.3 F 基因遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)測序結(jié)果，推導(dǎo)出NDV分離株F基因的氨基酸序列，確定aa112～aa117 裂解位點(diǎn)基序。參照Gen-Bank 中相關(guān)序列，利用MEGA 6 軟件對F基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用neighbor joining test（Maximum Composite Likelihood 模型）構(gòu)建系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹[2]。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果

經(jīng)過SPF 雞胚病毒分離和NDV 標(biāo)準(zhǔn)血清HI試驗(yàn)，結(jié)果共有13 份尿囊液為NDV HI 試驗(yàn)陽性。

2.2 F 基因擴(kuò)增和比對分析

13 份NDVF基因擴(kuò)增和測序后，blast 比對發(fā)現(xiàn)，分離株全部為CLASS Ⅰ基因1 b 亞型NDV。根據(jù)FO 蛋白裂解位點(diǎn)112-117 位氨基酸序列推測該毒株的致病性[3]，所有分離獲得的CLASS Ⅰ基因1 b亞型NDV 均為弱毒株。

2.3 F 基因的遺傳進(jìn)化分析

圖1 NDV F 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

根據(jù)Diel 等[2]提出的新的NDV 基因分型方法，采用F基因全長，構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，與blast 結(jié)果相符，獲取的13 個NDVF基因序列均歸屬于CLASS Ⅰ基因1 b 亞型分支（圖1）。

3 討 論

NDV 只有1 個血清型，但根據(jù)病毒F基因高變區(qū)序列差異可將毒株分為兩類：Ⅰ類（CLASS Ⅰ）和Ⅱ類（CLASS Ⅱ）。目前全世界范圍內(nèi)暴發(fā)的ND 流行毒株和常用疫苗株均屬于CLASS Ⅱ，至少包含Ⅰ-XVIII 18 個基因型。CLASS ⅠNDV 在2003 年首次從法國野生麻鴨中分離得到[4]，隨后也在中國被陸續(xù)報(bào)道[5]。CLASS ⅠNDV 絕大多數(shù)為無毒株或弱毒株，目前僅分離到2 個CLASS Ⅰ強(qiáng)毒株[6-7]，但CLASS ⅠNDV 可在雞或雞胚中傳代增強(qiáng)毒力[8]。因此，在進(jìn)行NDV 病原學(xué)監(jiān)測時，對CLASS ⅠNDV 的監(jiān)測也是重要內(nèi)容。

本研究中，從705 份雞的咽喉/泄殖腔棉拭子中分離到13 個NDV 毒株，分離率為1.84%，與本實(shí)驗(yàn)室2017 年的監(jiān)測結(jié)果相似[1]。分析這些毒株的F基因序列發(fā)現(xiàn)，13 個NDV 毒株均為CLASS ⅠNDV。CLASS ⅠNDV 在發(fā)現(xiàn)前期主要分布于水鳥、海鳥和水禽[9]，本研究結(jié)果表明，CLASS ⅠNDV已經(jīng)由水禽向陸生禽類傳播，這與王靜靜等[10]的研究結(jié)果相似。

根據(jù)Diel 提出的新的NDV 基因分型方法，CLASS ⅠNDV 只有1 個基因型，含1 a、1 b、1 c 3 個基因亞型[4]。使用這13 個NDV 分離株的F基因核苷酸序列與參考毒株繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，全部屬于CLASS Ⅰ1 b NDV。但這13 個毒株與CLASS Ⅰ1 b NDV 參考株分別位于2 個小分支，具有地域特征。說明NDV 在流行傳播的過程中，在不同地區(qū)也形成了自己的分子特征。后續(xù)還將對這些毒株進(jìn)行致病性試驗(yàn)和全基因序列測定，為Ⅰ類NDV 的流行傳播規(guī)律、病原學(xué)和分子特征提供更多數(shù)據(jù)。