安飛宇，武俊瑞，尤升波，解夢(mèng)汐，陳 旭，趙 越，包海燕，烏日娜,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100）

豆醬是以大豆和面粉為主要原料，經(jīng)自然發(fā)酵而成的半流動(dòng)狀態(tài)發(fā)酵食品，在我國(guó)北方地區(qū)稱為大醬[1]。傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬所具有的獨(dú)特色、香、味、體是在各種微生物的共同作用下，通過諸多生化反應(yīng)而形成的[2]，有研究表明，細(xì)菌、霉菌和酵母菌是豆醬發(fā)酵過程中的主要微生物[3]，這些微生物對(duì)于自然發(fā)酵豆醬品質(zhì)的形成起到了極其重要的作用。

近年來，自然發(fā)酵豆醬中微生物群落結(jié)構(gòu)在國(guó)內(nèi)外得到廣泛的關(guān)注和研究[4-6]，同時(shí)也發(fā)展了許多研究微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)[7]。研究方法先后經(jīng)歷了傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法[8]、基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)[9-10]、構(gòu)建克隆文庫(kù)和DNA測(cè)序等[11-12]。近年來，隨著測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步及測(cè)序成本的逐漸降低，科學(xué)界開始越來越多地應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究發(fā)酵食品中的微生物群落[13]。但僅在DNA層面上的測(cè)序，如16S rRNA基因測(cè)序和宏基因組測(cè)序，其結(jié)果中有很大一部分是已經(jīng)死亡的微生物，測(cè)序結(jié)果不能反映不同發(fā)酵階段菌落的真實(shí)情況，對(duì)發(fā)酵過程中實(shí)際發(fā)生的代謝反應(yīng)也只能是推測(cè)[14]，因此還需使用新技術(shù)對(duì)發(fā)酵體系中的活菌群落進(jìn)行分析。

宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)是后基因組時(shí)代最具代表性的新技術(shù)。宏轉(zhuǎn)錄組指的是在某個(gè)特定條件或時(shí)空，群落中所有微生物基因轉(zhuǎn)錄本的總和，可用于衡量微生物群落宏基因組的表達(dá)水平，篩選出高表達(dá)活性功能基因和微生物[15-16]。由于其是以微生物群落的總RNA為研究對(duì)象，因此宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在一定程度上彌補(bǔ)了基因組測(cè)序結(jié)果存在死亡菌種干擾的這一缺陷，其結(jié)果只反映取樣時(shí)體系中活菌的群落結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度。近年來，宏轉(zhuǎn)錄組開始應(yīng)用于如酸面團(tuán)、干酪等發(fā)酵食品[17-19]，用于探索發(fā)酵食品中活菌的群落結(jié)構(gòu)及功能，并通過分析各活菌群落在發(fā)酵過程中的代謝途徑揭示其對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)，而由于自然發(fā)酵豆醬體系復(fù)雜，其總RNA的提取存在一定困難，目前鮮見有將宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于發(fā)酵豆醬的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)基于宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)自然發(fā)酵豆醬初期和末期的兩個(gè)樣本進(jìn)行活菌群落檢測(cè)，建立了適用于豆醬這一復(fù)雜體系的總RNA提取方法，并對(duì)比分析了自然發(fā)酵豆醬在不同發(fā)酵時(shí)期的活菌群落結(jié)構(gòu)及功能，以期為揭示豆醬發(fā)酵過程中真正發(fā)揮作用的微生物和優(yōu)良發(fā)酵菌種的選育提供基本的技術(shù)支持，也可作為其他半固態(tài)發(fā)酵食品菌群分析的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RNA PowerSoil?Total RNA Isolation Kit美國(guó)Mobio公司；Ribo-Zero Magnetic Gold Kit 美國(guó)Epicentre公司；TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit美國(guó)Illumina公司；High Sensitivity DNA Kit美國(guó)Agilent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop分析儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；瓊脂糖凝膠電泳儀 北京市六一儀器廠；Centrifuge 5804R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；2100生物分析儀 美國(guó)Agilent公司；HiSeq測(cè)序系統(tǒng) 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

樣品取自遼寧省沈陽市遼中區(qū)一制醬經(jīng)驗(yàn)豐富的農(nóng)家，分別采集發(fā)酵第0天和第56天的豆醬樣品于無菌滅酶管中，后續(xù)采用兩種不同的樣品前處理方式：1）采樣后低溫運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)處理一次后再液氮速凍并轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存；2）采樣時(shí)直接液氮速凍并轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 RNA提取與質(zhì)檢

采用RNA PowerSoil?Total RNA Isolation Kit，抽提總RNA，對(duì)抽提完成的RNA樣品，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量判斷，要求RNA條帶完整，無降解。利用紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA進(jìn)行定量。

馬思特（上海）化學(xué)有限公司是總部在美國(guó)的Master Chemical Corporation設(shè)立的金屬切削液及相關(guān)設(shè)備專業(yè)制造商，于2002年在上海注冊(cè)成立的。馬思特（上海）化學(xué)有限公司是TRIM牌金屬切削液產(chǎn)品在亞洲地區(qū)的生產(chǎn)、研發(fā)和技術(shù)服務(wù)中心，也是為機(jī)加工行業(yè)提供化學(xué)品專業(yè)管理的服務(wù)商。

1.3.3 宏轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

首先將rRNA序列特異性的探針與總RNA雜交，然后利用磁珠去除rRNA探針復(fù)合物，最后再用乙醇沉淀法進(jìn)一步純化mRNA。使用Illumina公司的TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建。包括RNA片段化、cDNA合成、cDNA文庫(kù)構(gòu)建、PCR擴(kuò)增已經(jīng)加上接頭的DNA片段、文庫(kù)片段選擇與純化等步驟，各步驟遵照試劑盒生產(chǎn)商的操作指導(dǎo)完成。

用2100生物分析儀對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，合格的文庫(kù)應(yīng)該有單一的峰，無接頭。然后，在Promega QuantiFluor上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，合格的文庫(kù)計(jì)算后濃度應(yīng)在2 nmol/L以上。最后對(duì)合格的文庫(kù)在Illumina HiSeq X-ten平臺(tái)上進(jìn)行2h150 bp的雙端測(cè)序。將需要上機(jī)的文庫(kù)梯度稀釋，并按所需數(shù)據(jù)量比例混樣?；旌玫奈膸?kù)變性成單鏈進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

首先對(duì)測(cè)序下機(jī)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩查和過濾。質(zhì)控后對(duì)每個(gè)樣本的mRNA序列，分別采用Trinity進(jìn)行從頭組裝拼接[20]。將樣本序列與NCBI-NT數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)菌、古菌、真菌和病毒序列進(jìn)行BLASTN比對(duì)。運(yùn)用MEGAN軟件進(jìn)行物種分類注釋[21]。最后結(jié)合序列在各樣本中的豐度數(shù)據(jù)，使用QIIME軟件獲得各樣本在各個(gè)分類等級(jí)上的相對(duì)豐度分布表并繪制柱狀圖[22]。對(duì)各樣本組裝拼接后得到的所有轉(zhuǎn)錄本以0.95的相似度和0.9的最低覆蓋度進(jìn)行歸并去冗余，并以最長(zhǎng)的序列作為該Unigene的代表序列。將Unigene集與KEGG及CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，從而對(duì)轉(zhuǎn)錄本功能進(jìn)行注釋分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳分析

由于豆醬樣品中的大豆經(jīng)過高溫高壓蒸煮并長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵，因此提取物中不含植物源RNA。此外，自然發(fā)酵豆醬體系復(fù)雜且處于開放式的發(fā)酵環(huán)境，豆醬中存在大量的核糖核酸酶，其會(huì)對(duì)總RNA的提取造成影響，使得從豆醬中提取RNA存在一定難度。因此與傳統(tǒng)動(dòng)植物組織及發(fā)酵食品總RNA提取方式[23-26]不同，本實(shí)驗(yàn)嘗試不同的前處理方式，通過對(duì)總RNA抽提效果的比較建立最適用于豆醬這一復(fù)雜體系的總RNA提取方法。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，不同前處理方式所獲得的RNA質(zhì)量有明顯的差異。同時(shí)，不同發(fā)酵時(shí)期的總RNA提取效果也存在一定差異。

圖1 兩種不同前處理方式提取豆醬總RNA的電泳圖Fig. 1 Electropherograms of total RNA extracted from soybean paste by two different pretreatment methods

如圖1所示，經(jīng)過離心處理后的樣品能得到23S、16S條帶，條帶清晰，無明顯拖尾現(xiàn)象，且23S的亮度高于16S條帶，說明經(jīng)離心處理后提取的總RNA完整性較好，純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；而未經(jīng)離心處理的樣品RNA條帶相對(duì)較暗，尤其是發(fā)酵第0天條帶拖尾嚴(yán)重，完整性較差，無法滿足宏轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)要求。同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)酵第0天的豆醬電泳條帶亮度明顯弱于發(fā)酵第56天，說明發(fā)酵初期豆醬所抽提的RNA濃度可能低于發(fā)酵末期。

2.2 總RNA質(zhì)量分析

表1 RNA檢測(cè)結(jié)果Table 1 Quality evaluation of total RNA

使用2100生物分析儀檢測(cè)RNA樣品的純度、質(zhì)量濃度和完整性（表1）。除有明顯拖尾的H0（b）外，樣品通過離心處理所提取的RNA質(zhì)量濃度較高，分別為30.45、44.68 ng/μL。該結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果一致，說明發(fā)酵初期豆醬所抽提的RNA質(zhì)量濃度低于發(fā)酵末期。其可能的原因?yàn)?，在發(fā)酵第0天豆醬體系剛剛混入鹽水，水分含量較高，并且發(fā)酵環(huán)境的巨大改變也可能會(huì)造成RNA降解。到發(fā)酵后期，豆醬水分含量降低且豆醬體系穩(wěn)定，因此抽提相對(duì)容易。

純度較好的RNA其OD260nm/OD280nm值應(yīng)介于1. 8～2.0。若OD260nm/OD280nm值小于1.8，則表明多糖、蛋白和酚類物質(zhì)較多，若OD260nm/OD280nm值大于2.0，則表明RNA有部分降解[23]。本實(shí)驗(yàn)各樣品所抽提RNA的OD260nm/OD280nm值在1.90～2.11之間，其中通過離心處理的樣品所抽提的RNA降解較少；而OD260nm/OD280nm值均低于1.0，說明可能仍有部分雜質(zhì)殘留，但不影響后續(xù)文庫(kù)的建立。除未經(jīng)離心處理的H0樣品外，RNA完整數(shù)目（RNA integrity number，RIN）值均大于7，所提取的RNA完整性較好。檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)離心處理提取的RNA質(zhì)量濃度純度和總量均符合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要求。

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及序列組裝

宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序涉及到擴(kuò)增環(huán)節(jié)的有兩個(gè)步驟，一個(gè)是RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA時(shí)的逆轉(zhuǎn)錄-PCR，一個(gè)是測(cè)序過程中的橋式PCR，均不具明顯的擴(kuò)增偏好性。同時(shí)，為保證后續(xù)分析質(zhì)量可靠，對(duì)測(cè)序下機(jī)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩查和過濾，獲得可用于后續(xù)分析的有效序列集（Clean Data），并統(tǒng)計(jì)其占測(cè)序原始數(shù)據(jù)的比例。其結(jié)果如表2所示。去除低質(zhì)序列后，各個(gè)樣品的Clean Data獲得率均在96%以上，Clean Reads獲得率達(dá)到99%以上，數(shù)據(jù)質(zhì)量足夠滿足分析需要。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistical analysis of sequencing data

在得到高質(zhì)序列后由Trinity軟件進(jìn)行拼接組裝[19]，相應(yīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示，不同發(fā)酵時(shí)期豆醬分別獲得154 922 條和22 552 條序列，且拼接效果良好。

表3 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of assembly results

2.4 宏轉(zhuǎn)錄組物種注釋和豐度分析

將樣本序列與NCBINT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。使用Krona軟件進(jìn)行菌群分類學(xué)組成的交互展示[27]（圖2），圖中圓圈從內(nèi)到外依次代表界、門、綱、目、科、屬6 個(gè)分類水平，扇形的大小反映了不同分類單元的相對(duì)豐度高低。在每個(gè)分類水平，各單元以不同的顏色加以區(qū)分。

如圖2所示，相對(duì)豐度最高的門類為厚壁菌門（Firmicutes）。發(fā)酵初期（H0）豆醬的活菌群落結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，除厚壁菌門（81.6%）外，Mucoromycota（3.8%）和子囊菌門（Ascomycota，3.8%）為主要菌門。在發(fā)酵末期（H56）厚壁菌門（Firmicutes）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度為99.0%。在屬水平上，自然發(fā)酵豆醬的主要微生物菌屬為四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、太平洋海洋桿菌屬（Oceanobacillus）和腸球菌屬（Enterococcus），均為細(xì)菌菌屬。在發(fā)酵初期，其活菌群落結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，除相對(duì)豐度最高的四聯(lián)球菌（Tetragenococcus，34.6%）外，還鑒定出大量的葡萄球菌屬（Staphylococcus，24.9%），但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄球菌屬相對(duì)含量迅速降低，說明其可能為制醬初期所引入的雜菌，對(duì)豆醬的發(fā)酵作用影響不大。此外，在發(fā)酵初期有一定數(shù)量的真菌被檢出，如根霉菌屬（Rhizopus，3.06%）、曲霉菌屬（Aspergilus，2.71%），但到了發(fā)酵末期，真菌菌屬豐度大幅降低，自然發(fā)酵豆醬中活菌群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，主要的菌屬為四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus，70.9%）和乳桿菌屬（Lactobacillus，20.0%）。四聯(lián)球菌屬是促進(jìn)健康的益生菌，它廣泛存在于豆醬、醬油、魚醬等發(fā)酵食品中，在改善豆醬風(fēng)味方面具有重要作用[28]。有研究表明[29]，豆醬中的乳桿菌主要是植物乳桿菌，其不僅有利于食品的發(fā)酵，還可以改善食物的風(fēng)味，且具有一定益生特性，包括維持腸道內(nèi)菌群平衡、抑制腫瘤細(xì)胞的形成、降低血清膽固醇等[30]。此外，有部分序列被注釋為病毒，但其相對(duì)含量極低，一些潛在致病菌如葡萄球菌屬（Staphylococcus）也僅在發(fā)酵初期才有較高豐度，其含量會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，因此認(rèn)為豆醬不具消費(fèi)風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)證明宏轉(zhuǎn)錄技術(shù)完全可以用于自然發(fā)酵豆醬活菌群落結(jié)構(gòu)分析，而且此技術(shù)具有一定的敏感性，可以顯示出豆醬發(fā)酵初期與末期間活菌群落的差異，同時(shí)也證明豆醬在自然發(fā)酵過程中微生物群落演替是一個(gè)逐漸趨于穩(wěn)定的過程。

圖2 基于Krona的分類學(xué)組成信息交互展示圖Fig. 2 Krona-based taxonomic composition information interactive display

2.5 宏轉(zhuǎn)錄組功能注釋和豐度分析

2.5.1 KEGG功能注釋

基于各Unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的功能注釋結(jié)果，使用QIIME軟件，獲取各樣本對(duì)應(yīng)于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)第1和第2功能等級(jí)的相對(duì)表達(dá)量分布，其結(jié)果如圖3所示。在第1等級(jí)的代謝通路分類中（圖3A），代謝表達(dá)量占比最高，達(dá)到總體表達(dá)量的35.9%。發(fā)酵0 d時(shí)，代謝功能占其總表達(dá)量的27.5%，后隨著發(fā)酵的進(jìn)行迅速升高，發(fā)酵第56天時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量為44.2%。

圖3 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)相對(duì)表達(dá)量分布統(tǒng)計(jì)圖Fig. 3 KEGG database relative expression distribution statistics at (A)fi rst and (B) second levels

進(jìn)一步對(duì)代謝通路子功能進(jìn)行分析，如圖3B所示，在第2等級(jí)的代謝通路分類中，碳水化合物代謝功能表達(dá)量占比最高，達(dá)到總體表達(dá)量的18.4%。在發(fā)酵第0、56天的相對(duì)表達(dá)量分別為12.0%和24.8%，這表明自然發(fā)酵豆醬菌群對(duì)淀粉具有較高的利用率。其中糖酵解/糖異生和TCA循環(huán)所注釋到的表達(dá)量最高，分別為總體表達(dá)量的4.5%和3.7%。微生物可通過糖酵解途徑將糖類分解成乙醇和二氧化碳[31]，其有助于豆醬的風(fēng)味產(chǎn)生，因此在發(fā)酵后期該功能表達(dá)量升高。此外，氨基酸代謝功能表達(dá)量也相對(duì)較高，達(dá)到總體表達(dá)量的4.7%，在發(fā)酵第0天及第56天的相對(duì)表達(dá)量分別為3.4%和6.0%。該結(jié)果與其他組學(xué)研究結(jié)果一致[32-34]，說明宏轉(zhuǎn)錄技術(shù)可以用于分析自然發(fā)酵豆醬活菌群落功能。

2.5.2 CAZy功能比較分析

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵豆醬中的微生物活動(dòng)大多與碳水化合物代謝有關(guān)，因此后續(xù)進(jìn)行CAZy注釋分析?；诓煌l(fā)酵階段樣本在CAZy功能數(shù)據(jù)庫(kù)中所注釋到的相對(duì)表達(dá)量，可以比較它們?cè)趦蓸颖鹃g的倍數(shù)差異關(guān)系，從而評(píng)估各樣本所分別富集的功能類群。如圖4所示，除糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶在H0中有略高表達(dá)量外，其他4 個(gè)功能類群包括碳水化合物結(jié)合模塊、輔助氧化還原酶、碳水化合物酯酶以及多糖裂解酶均在H56中有較高的活性表達(dá)。

圖4 CAZy蛋白模塊比較分析圖Fig. 4 Comparative analysis of CAZy protein modules

微生物產(chǎn)生的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶能生成低聚糖。相關(guān)研究表明，發(fā)酵末期有機(jī)碳和可溶性糖含量都逐漸下降并保持恒定[35]，說明糖苷水解酶及糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)代謝反應(yīng)已經(jīng)基本完成。此外，由于在發(fā)酵前期鹽濃度較高且含氧量較低，霉菌已經(jīng)基本停止生長(zhǎng)，但由霉菌分泌的各種酶類仍繼續(xù)發(fā)揮作用[36]，而到了發(fā)酵末期，霉菌豐度極低，無法分泌相關(guān)酶類，這可能是發(fā)酵末期糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)活性降低的主要原因。該結(jié)果也與宏轉(zhuǎn)錄組物種注釋結(jié)果一致，再次印證宏轉(zhuǎn)錄技術(shù)可以用于分析自然發(fā)酵豆醬活菌群落結(jié)構(gòu)及功能，且分析結(jié)果準(zhǔn)確。

3 結(jié) 論

近年來，自然發(fā)酵豆醬中微生物群落結(jié)構(gòu)及功能在國(guó)內(nèi)外得到廣泛的關(guān)注[4-6]，為反映自然發(fā)酵豆醬菌落的真實(shí)情況，免除傳統(tǒng)分子生物學(xué)手段所帶來的死亡菌群干擾，故嘗試使用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)豆醬發(fā)酵體系中的活菌群落進(jìn)行分析。

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)豆醬總RNA提取的前處理方法進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果表明，與傳統(tǒng)植物組織或發(fā)酵食品樣品前處理方式不同[23-26]，對(duì)豆醬樣品進(jìn)行離心處理可以很好地解決復(fù)雜發(fā)酵體系對(duì)RNA提取的影響，這種樣品前處理方式對(duì)發(fā)酵初期豆醬總RNA提取的幫助尤為明顯。然后對(duì)豆醬活菌菌群結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行注釋，根據(jù)NCBI的注釋結(jié)果，以相對(duì)豐度不低于0.01為閾值，共鑒定出13 個(gè)屬的15 種微生物，其中細(xì)菌占絕大多數(shù)，主要的細(xì)菌屬為四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）。根霉菌屬（Rhizopus）、曲霉菌屬（Aspergilus）僅在發(fā)酵初期有較高豐度，其可能是由醬醅引入的，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，真菌豐度大幅降低，說明在醬醪發(fā)酵階段，細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)微生物，在發(fā)酵過程中起主導(dǎo)作用。其物種注釋結(jié)果與先前報(bào)道可以相互印證[4,6,9-10]，證明宏轉(zhuǎn)錄技術(shù)完全可以用于自然發(fā)酵豆醬活菌群落結(jié)構(gòu)分析，在顯示出豆醬發(fā)酵初期與末期間活菌群落的差異的同時(shí)，也證明豆醬在自然發(fā)酵過程中微生物群落演替是一個(gè)趨于穩(wěn)定的過程。在功能注釋方面，通過KEGG功能注釋和CAZy功能比較分析，發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵豆醬中微生物功能主要集中在碳水化合物和氨基酸代謝，其中在真菌豐度較高的發(fā)酵初期，糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)代謝反應(yīng)活性較高，該結(jié)果也與宏轉(zhuǎn)錄組物種注釋結(jié)果一致，再次印證宏轉(zhuǎn)錄技術(shù)可以用于分析自然發(fā)酵豆醬活菌群落結(jié)構(gòu)及功能，且具有良好的靈敏度及穩(wěn)定性。將該技術(shù)與其他組學(xué)技術(shù)數(shù)據(jù)整合，將有利于挖掘出更多的有益菌株和潛在的功能基因應(yīng)用于未來的工業(yè)生產(chǎn)，同時(shí)還可將該實(shí)驗(yàn)體系應(yīng)用于其他半固態(tài)發(fā)酵食品的活菌群落分析。