李貝貝，杜馨，張敏，姜宏

顆粒細胞的線粒體參與眾多細胞內(nèi)物質(zhì)代謝，可利用葡萄糖的代謝產(chǎn)物丙酮酸為卵母細胞腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合成提供底物[1]，并保護卵母細胞免受氧化應激損傷[2]，正常的線粒體功能及顆粒細胞-卵母細胞間的相互作用是卵母細胞正常發(fā)育的必要條件[3]。本文對近年有關(guān)顆粒細胞線粒體功能與卵母細胞發(fā)育相關(guān)性的研究進展進行綜述。

1 卵巢顆粒細胞與卵母細胞

卵泡是卵巢的基本功能單位，竇卵泡期卵巢顆粒細胞開始分化，根據(jù)其位置和功能分為兩類，即位于壁層的顆粒細胞和圍繞卵母細胞的卵丘顆粒細胞。前者是卵泡中具有分泌功能的主要細胞；后者與卵子在結(jié)構(gòu)上緊密連接，形成卵丘細胞-卵母細胞復合體。在卵泡發(fā)生過程中，顆粒細胞與卵母細胞共享生長、成熟、衰老及退化信號，卵丘顆粒細胞可通過向卵母細胞輸入卵母細胞轉(zhuǎn)錄信號、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、鈣離子及其他代謝物，促使卵母細胞從靜止狀態(tài)激活，支持卵母細胞核和細胞質(zhì)的成熟，而卵母細胞可分泌促進卵丘顆粒細胞分化和增殖的生長因子，維持和增強顆粒細胞功能。

卵母細胞與顆粒細胞主要通過縫隙連接蛋白43和連接蛋白45進行雙向信息交流及新陳代謝物質(zhì)傳遞[4]，縫隙連接的變化可改變卵母細胞成熟狀態(tài)[5]。此外，卵母細胞與卵丘顆粒細胞間部分信號傳遞由配體和受體介導。動物實驗證實，小鼠壁層顆粒細胞表達C型鈉肽配體，卵丘顆粒細胞則存在C型鈉肽受體，兩者結(jié)合可控制卵母細胞減數(shù)分裂[6]。研究顯示，與成熟卵母細胞的卵丘顆粒細胞共培養(yǎng)后可提高卵母細胞成熟率，表明卵丘顆粒細胞在卵母細胞最終成熟和排卵過程中發(fā)揮不可或缺的作用[7]。

cAMP由腺苷酸環(huán)化酶分解ATP產(chǎn)生，是哺乳動物卵母細胞成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，調(diào)控卵母細胞減數(shù)分裂的停止和恢復，在卵母細胞和卵丘顆粒細胞發(fā)育過程中起重要作用。排卵前，卵丘顆粒細胞產(chǎn)生的cAMP可通過縫隙連接運送到卵母細胞內(nèi)，對卵母細胞核成熟有抑制和促進雙重作用，持續(xù)升高的cAMP對卵子成熟起抑制作用，而短暫升高的cAMP則可促進卵母細胞核成熟[8]。哺乳動物中，卵母細胞cAMP水平的上升可抑制或延遲減數(shù)分裂的恢復，但這一現(xiàn)象在無卵丘顆粒細胞的裸卵中則不會發(fā)生[9]。

此外，卵母細胞還可通過旁分泌調(diào)節(jié)周圍顆粒細胞的增殖、分化、凋亡及黃素化，表明在卵母細胞發(fā)育成熟過程中，顆粒細胞與卵母細胞相互影響，缺一不可[10]，卵丘細胞-卵母細胞復合體間的多條信號通路是卵母細胞發(fā)育的關(guān)鍵因素。

2 線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)

線粒體是一類屬于母系遺傳的細胞器，為眾多細胞活動提供能量，并參與活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的管理和細胞凋亡的調(diào)控，是影響女性生殖過程的重要因素[11]。

MtDNA拷貝數(shù)是指線粒體基因組的數(shù)量，具有細胞間特異性，與線粒體功能密切相關(guān)，是衡量線粒體功能的重要指標。MtDNA通過編碼呼吸鏈的多種組成成分參與細胞氧化磷酸化及ATP的合成過程，調(diào)控細胞的代謝和功能。顆粒細胞通過表達與mtDNA復制有關(guān)的信息因子，對卵母細胞發(fā)育過程中維持足夠的mtDNA起重要作用。研究表明，顆粒細胞的mtDNA拷貝數(shù)與相應卵母細胞的mtDNA拷貝數(shù)呈正相關(guān)[12]，卵巢儲備功能下降患者顆粒細胞凋亡率增高[13]，顆粒細胞中mtDNA拷貝數(shù)顯著低于卵巢儲備功能正?；颊遊12]。此外，卵丘顆粒細胞中mtDNA拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量密切相關(guān)，優(yōu)質(zhì)胚胎的卵丘顆粒細胞mtDNA拷貝數(shù)顯著高于質(zhì)量較差胚胎的卵丘顆粒細胞[14]，卵丘顆粒細胞mtDNA拷貝數(shù)可以較好地預測體外受精過程中的胚胎質(zhì)量，陽性預測值為84.4%，陰性預測值為82.1%[15]。

3 MtDNA突變及缺失

MtDNA 4 977 bp片段缺失是最為常見的mtDNA變異類型，可導致大量線粒體基因缺失，包括ATP酶6和ATP酶8基因、細胞色素氧化酶和泛醌還原酶相關(guān)基因等[16]，mtDNA 4 977 bp片段基因缺失的積累效應可導致線粒體功能障礙、ATP合成受損和細胞凋亡。

關(guān)于顆粒細胞中mtDNA是否存在4 977 bp片段缺失的報道不一。有學者認為卵巢儲備功能正常及卵巢儲備功能下降患者均不存在顆粒細胞mtDNA 4 977 bp片段缺失[17]，且年齡的升高并不增加卵丘顆粒細胞mtDNA 4 977 bp片段缺失率[18]。也有學者認為顆粒細胞存在mtDNA 4 977 bp片段缺失，且女性年齡與mtDNA突變率存在一定的關(guān)聯(lián)，38歲以下婦女顆粒細胞mtDNA 4 977 bp片段的缺失率為41.7%，而≥38歲婦女缺失率高達100%[19]。

4 線粒體相關(guān)基因

線粒體相關(guān)基因與其產(chǎn)物在卵母細胞的形成和發(fā)育中扮演重要角色。卵母細胞與其周圍的顆粒細胞間存在復雜且功能強大的基因通路，可調(diào)控卵母細胞及胚胎的發(fā)育潛能，卵丘顆粒細胞線粒體相關(guān)基因表達水平可作為評估卵母細胞質(zhì)量的潛在生物標志物[20]。

PPARGC1A是調(diào)節(jié)線粒體生物合成的重要基因，有研究發(fā)現(xiàn)卵巢儲備功能下降患者卵丘顆粒細胞的PPARGC1A基因表達水平顯著下調(diào)[12]。在卵泡發(fā)育的后期階段，顆粒細胞中與糖酵解有關(guān)的基因（如磷酸果糖激酶、M2型丙酮酸激酶同工酶、乳酸脫氫酶等）表達水平均顯著上調(diào)[21]。

線粒體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯依賴核基因編碼的各種蛋白因子的調(diào)控，在哺乳動物中已經(jīng)鑒定出的兩種轉(zhuǎn)錄因子有：線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM） 與線粒體轉(zhuǎn)錄因子B（mitochondrial transcription factor B，TFBM）。在哺乳動物線粒體生成中起到主要調(diào)節(jié)作用的是TFAM。TFAM是由TFAM基因在胞質(zhì)內(nèi)形成的246個氨基酸組成的小分子多肽，在線粒體靶向序列的轉(zhuǎn)運下進入線粒體形成TFAM蛋白，TFAM以二聚體形式特異性結(jié)合到線粒體基因組的兩個主要啟動子——重鏈啟動子（HSP）和輕鏈啟動子（LSP）上游的特定位點，并通過募集線粒體RNA聚合酶和TFBM共同組成轉(zhuǎn)錄起始復合物，在線粒體中作為mtDNA轉(zhuǎn)錄的激活劑，激活線粒體的生物合成，調(diào)節(jié)mtDNA的轉(zhuǎn)錄、復制，維持mtDNA穩(wěn)定性。因而，TFAM被認為是一種具有多效性功能的核基因編碼的DNA結(jié)合蛋白，是生殖細胞mtDNA拷貝數(shù)的決定因子，可影響卵母細胞中mtDNA拷貝數(shù)，同時也參與線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的過程[22]。

哺乳動物TFAM基因大小不一，長10～25 kb，一般含有6個內(nèi)含子、7個外顯子。TFAM基因啟動子上存在多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄因子通過與TFAM基因的結(jié)合位點結(jié)合而調(diào)控該基因的表達。因TFAM與mtDNA拷貝數(shù)相關(guān)，被認為其可能是治療線粒體相關(guān)疾病的一個有效靶點，目前已有大量關(guān)于TFAM與線粒體相關(guān)疾病的研究。研究發(fā)現(xiàn)，TFAM有利于卵母細胞發(fā)育、胚胎生長發(fā)育及提高受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率，推測TFAM可能通過影響卵母細胞的成熟，尤其是胞質(zhì)成熟，繼而影響體外受精-胚胎移植的妊娠結(jié)局，且TFAM的表達存在閾值，顆粒細胞TFAM mRNA水平過低或者過高均會對卵母細胞質(zhì)量產(chǎn)生影響[23]。推測TFAM可以作為卵母細胞發(fā)育能力的預測因子，可能將為臨床和實驗室的輔助生育工作作出貢獻。但顆粒細胞中TFAM的相關(guān)研究還不多，還需要更多研究證實。

5 線粒體跨膜電位

線粒體膜上存在通透性轉(zhuǎn)換孔，其是由多個蛋白質(zhì)組成的復合孔道，當其高水平開放時可導致線粒體膜電位降低，進一步導致線粒體腫脹，ATP水解，離子穩(wěn)態(tài)被打破，細胞ATP水平下降，細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子水平上升，細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，未成熟的卵母細胞周圍卵丘顆粒細胞線粒體膜電位顯著低于成熟卵母細胞。此外，卵丘顆粒細胞線粒體膜電位的降低，可影響卵母細胞核與細胞質(zhì)成熟的同步性[24]。體外受精過程中卵丘顆粒細胞線粒體膜電位與總獲卵數(shù)、成熟卵母細胞數(shù)和正常受精卵母細胞數(shù)、6～8細胞胚胎數(shù)及囊胚數(shù)呈正相關(guān)[25]。

6 ATP水平

ATP是細胞能量供給的直接形式。卵母細胞主要依賴氧化磷酸化獲取能量，顆粒細胞則主要依靠糖酵解獲得能量，并通過縫隙連接將葡萄糖代謝產(chǎn)物輸送至卵母細胞，維持卵母細胞的能量供給。顆粒細胞ATP水平與卵母細胞的發(fā)育和質(zhì)量密切相關(guān)，包繞顆粒細胞的卵母細胞在成熟過程中ATP水平明顯高于裸卵[26]。卵丘顆粒細胞中高度極化的線粒體是成熟哺乳動物卵母細胞的重要ATP來源，卵丘顆粒細胞ATP水平與獲卵數(shù)、成熟卵母細胞比例、著床率及妊娠結(jié)局密切相關(guān)[27]。

7 ROS水平

ROS是一類來源于細胞代謝的高活性氧自由基，是氧化應激反應的重要標志物，是線粒體的產(chǎn)物，亦被當作線粒體功能指標的一種。在生殖細胞發(fā)育和成熟過程中，對能量和營養(yǎng)物質(zhì)的需求不可避免地加快了新陳代謝速率，導致ROS積累。生理水平的ROS對卵母細胞成熟、排卵和早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要。ROS過量則可誘發(fā)氧化應激反應，導致線粒體損傷，ATP含量降低，影響卵母細胞減數(shù)分裂過程中紡錘體的形成和基因組的穩(wěn)定，并導致顆粒細胞凋亡率增加，而顆粒細胞凋亡與體外受精-胚胎移植過程中低獲卵率、低受精率、低卵裂率、低妊娠率及空卵泡綜合征的發(fā)生密切相關(guān)[7]。卵泡液的ROS主要來自卵子及其周圍的顆粒細胞，卵母細胞膜因為富含多聚不飽和脂肪酸更容易受到ROS攻擊，及時有效清除ROS及其產(chǎn)物對于防止ROS進入卵母細胞、保證卵母細胞正常減數(shù)分裂非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，卵泡液中高ROS水平與獲卵數(shù)、卵母細胞和胚胎質(zhì)量呈負相關(guān)[28]。

8 線粒體功能的改善

目前生殖細胞線粒體功能的改善方法包括線粒體移植、極體移植、使用線粒體營養(yǎng)劑等。2004年已有學者將顆粒細胞線粒體移植到體外受精-胚胎移植反復妊娠失敗和高齡患者的卵子中，提高了患者的囊胚形成率，且獲得了38.89%的臨床妊娠率，證實利用自體顆粒細胞線粒體改善卵子質(zhì)量的可行性，但研究的樣本量較小[29]。在人或動物卵母細胞中進行顆粒細胞線粒體移植，結(jié)果均證明顆粒細胞線粒體移植對改善卵母細胞發(fā)育潛能具有非常重要的作用。

綜上所述，在卵子成熟過程中，顆粒細胞線粒體作為細胞質(zhì)內(nèi)最重要的細胞器，其氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的能力、mtDNA拷貝數(shù)、mtDNA突變或缺失水平、ROS水平、線粒體膜電位、線粒體相關(guān)基因表達水平等對卵母細胞發(fā)育成熟有著重要的影響，與卵子發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局密切相關(guān)，可作為評估卵母細胞質(zhì)量及改善卵母細胞發(fā)育潛能的替代細胞。對卵子成熟過程中顆粒細胞線粒體功能狀況的研究有助于揭示卵母細胞發(fā)育的機制，從而進一步了解卵母細胞發(fā)育相關(guān)的生殖生理，為改善卵母細胞發(fā)育潛能提供新的思路。