姚瑩，武露明，何曉，張學(xué)紅

近年臨床上通過(guò)放療和化療成功治療了70%以上的兒童癌癥，但是這些治療所致性腺損害后引起的不育癥是長(zhǎng)期影響癌癥患者的不良癥狀之一，相關(guān)學(xué)者通過(guò)冷凍保存睪丸組織保持男性生育能力和預(yù)防年輕癌癥患者不育癥[1-2]。然而，由于凍融睪丸組織的自體移植存在癌細(xì)胞再次植入風(fēng)險(xiǎn)，所以從凍存的睪丸組織中分離精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSCs）并且通過(guò)體外培養(yǎng)促進(jìn)SSCs增殖分化產(chǎn)生功能性單倍體精子給不育男性帶來(lái)極大的希望。此外，SSCs體外培養(yǎng)對(duì)其他不育患者（如非梗阻性無(wú)精子癥，睪丸唯支持細(xì)胞綜合征等）恢復(fù)生育力也具有非常重要的意義[3-4]。但是睪丸組織中的SSCs數(shù)量較少[5]。因此，探索支持SSCs增殖并維持其功能和遺傳完整性的良好培養(yǎng)方法是未來(lái)研究的重點(diǎn)方向。目前，為了模擬精子發(fā)生，已有不少學(xué)者開(kāi)發(fā)了各種體外培養(yǎng)系統(tǒng)，盡管尚未達(dá)到體外完全生精的最終目的，但在該領(lǐng)域也取得了很大的進(jìn)步。本文主要綜述SSCs體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)，以便為進(jìn)一步改良培養(yǎng)方法提供思路。

1 SSCs

SSCs是位于睪丸曲細(xì)精管基底膜上的一小群生殖細(xì)胞，持續(xù)進(jìn)行著高度協(xié)調(diào)有序的精子發(fā)生。SSCs作為生殖干細(xì)胞，與胚胎干細(xì)胞一樣具有增殖、分化潛能。對(duì)于成年男性來(lái)講，SSCs是唯一可以不斷地產(chǎn)生精子并將遺傳信息傳遞給下一代的生殖細(xì)胞。SSCs的自我更新和分化受內(nèi)因和外因的精確調(diào)控。SSCs存在的微環(huán)境稱作干細(xì)胞生態(tài)位，也稱壁龕。SSCs壁龕中的體細(xì)胞（如支持細(xì)胞）為SSCs增殖分化提供重要的生長(zhǎng)因子：堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）[6-7]。間質(zhì)細(xì)胞和管周細(xì)胞為SSCs提供定位所必需的指導(dǎo)信號(hào)[8]，主要由膠原蛋白Ⅳ、層黏連蛋白、巢蛋白和基底膜聚糖組成的基底膜為SSCs提供錨固基礎(chǔ)[9]。然而，目前對(duì)SSCs的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)不夠，在輔助生殖技術(shù)和干細(xì)胞治療方面還沒(méi)有充分發(fā)揮其潛力，這在很大程度上是由于缺乏對(duì)SSCs壁龕組成以及SSCs自我更新所涉及的復(fù)雜調(diào)控途徑的全面了解。

2 SSCs體外培養(yǎng)

為了提高體外培養(yǎng)中SSCs的增殖分化效率、進(jìn)行相關(guān)基因和藥理學(xué)研究，從20世紀(jì)80年代至今，SSCs體外培養(yǎng)法得到了逐步的改進(jìn)和完善。傳統(tǒng)的二維體外培養(yǎng)法是在培養(yǎng)皿上涂一層薄薄的明膠、膠原蛋白或基質(zhì)[10]，在此基礎(chǔ)上根據(jù)有無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的添加可分為飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法和無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法。Maghen等[11]用人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層與SSCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)SSCs增殖能力顯著提高。雖然飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法可以為SSCs體外生長(zhǎng)提供機(jī)械支持和各種生長(zhǎng)因子，但此培養(yǎng)條件復(fù)雜且不可控。Suyatno等[12]在無(wú)血清和飼養(yǎng)層條件下用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿，并在培養(yǎng)皿中添加GDNF和牛白血病抑制因子（bLIF），發(fā)現(xiàn)牛的SSCs體外培養(yǎng)可長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月。雖然二維體外培養(yǎng)法也取得了一定研究成果，但是由于二維培養(yǎng)法缺乏相對(duì)立體的空間結(jié)構(gòu)而不能有效地模擬體內(nèi)SSCs壁龕，導(dǎo)致SSCs分化效率相對(duì)較低。為了探索一種能有效替代基底膜和體細(xì)胞的體外環(huán)境劑，以構(gòu)建支持精子發(fā)生發(fā)展的小管結(jié)構(gòu)，三維培養(yǎng)系統(tǒng)越來(lái)越受關(guān)注。SSCs的三維培養(yǎng)，是把從曲細(xì)精管中分離出的生殖細(xì)胞植入到相對(duì)較厚（幾毫米至幾厘米）的半固體培養(yǎng)基中，為SSCs和其他體細(xì)胞的接觸提供支持媒介，維持或部分維持干細(xì)胞龕（niche）的功能，從而完成精子發(fā)生過(guò)程[10]。Sun等[13]通過(guò)減數(shù)分裂染色質(zhì)擴(kuò)散和DNA含量測(cè)定表明人類SSCs在三維培養(yǎng)下可以分化為功能性單倍體精子，并且此單倍體精子能夠使小鼠卵母細(xì)胞受精，使雜交胚胎的發(fā)育成為可能。此外該研究還發(fā)現(xiàn)，與二維培養(yǎng)法相比，三維培養(yǎng)法在SSCs分化為精母細(xì)胞和精細(xì)胞過(guò)程中誘導(dǎo)基因表達(dá)的作用更好。

3 三維培養(yǎng)法

現(xiàn)有4種三維培養(yǎng)法的組成和特點(diǎn)，見(jiàn)表1。下面詳述各方法的研究現(xiàn)狀。

3.1 軟瓊脂三維培養(yǎng)法 瓊脂是一種從紅海雜草中提取的生物相容性復(fù)雜多糖，Lin等[14]首次使用瓊脂建立三維軟瓊脂培養(yǎng)系統(tǒng)（soft-agar culture system，SACS），發(fā)現(xiàn)了骨髓干細(xì)胞的克隆擴(kuò)增特征。此后，多個(gè)研究小組利用三維SACS研究雄性生殖細(xì)胞的體外增殖分化。2008年有學(xué)者在SSCs體外培養(yǎng)中引入三維SACS，該系統(tǒng)是由基于不同瓊脂濃度的兩個(gè)部分組成，包括富集SSCs的凝膠相和富含體細(xì)胞（如支持細(xì)胞）的固體相[10]。將從10日齡小鼠獲得的SSCs與凝膠相（0.35%瓊脂）混合在固體相（0.5%瓊脂）中孵育時(shí)，觀察到減數(shù)分裂階段的特異性標(biāo)志物表達(dá)，表明將體細(xì)胞與生殖細(xì)胞共培養(yǎng)能有效地促進(jìn)生殖細(xì)胞增殖、分化。2012年Abu Elhija等[15]在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)三維SACS可作為減數(shù)分裂前生殖細(xì)胞向減數(shù)分裂后生殖細(xì)胞分化并且最終產(chǎn)生功能性單倍體精子的體外培養(yǎng)法。由于所有技術(shù)在用于臨床前必須在其他物種包括在人類中進(jìn)行重復(fù)成功驗(yàn)證。2016年Reda等[16]在大鼠實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)SSCs在三維SACS體外培養(yǎng)中可成功分化為具有圓形精子形態(tài)特征和蛋白標(biāo)記的單倍體精子。有研究發(fā)現(xiàn)與小鼠相比，大鼠睪丸放療后生精功能恢復(fù)延遲，但恢復(fù)期比人類短，所以大鼠模型的應(yīng)用被認(rèn)為是從小鼠模型向臨床應(yīng)用邁進(jìn)的過(guò)程[17]。2019年Mohammadzadeh等[3]從非阻塞性無(wú)精子癥患者中分離的SSCs先置于指定培養(yǎng)基上增殖3周，然后將增殖的SSCs分別置于三維SACS組、明膠組和對(duì)照組中培養(yǎng)2周，三維SACS組的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量明顯高于其他兩組，培養(yǎng)前僅在睪丸細(xì)胞中觀察到Oct4（SSCs干細(xì)胞性標(biāo)記基因）表達(dá)，培養(yǎng)7 d后，在三維SACS組和明膠組中觀察到Stra8（減數(shù)分裂前標(biāo)記基因）的最大表達(dá)，但在培養(yǎng)14 d后，其表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與其他組相比，三維SACS組14 d后Scp3（減數(shù)分裂中標(biāo)記基因）和Acrosin（減數(shù)分裂后標(biāo)記基因）的表達(dá)更高，說(shuō)明三維SACS對(duì)人SSCs的增殖和分化具有積極作用，同時(shí)由于三維SACS組克隆的細(xì)胞團(tuán)數(shù)明顯高于明膠組，進(jìn)一步表明三維培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)于二維培養(yǎng)系統(tǒng)。然而，SACS在體外生精中的應(yīng)用并非沒(méi)有缺陷，有研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的最初24 h內(nèi)，有相當(dāng)一部分鼠類SSCs（40%～70%）從SACS的上層凝膠階段丟失，這可能是由于細(xì)胞相互作用的喪失和隨后觸發(fā)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，甚至有證據(jù)表明人類生精細(xì)胞無(wú)法有效地在三維SACS中完成整個(gè)生精周期[18-19]。

表1 4種三維培養(yǎng)法的組成及特點(diǎn)

3.2 甲基纖維素三維培養(yǎng)法 甲基纖維素是一種非離子纖維素醚，其是通過(guò)醚化在纖維素中引入甲基而制成的。甲基纖維素有4種重要功能：增稠、表面活性、成膜性以及形成熱凝膠（冷卻時(shí)熔化）。2009年Stukenborg等[18]提出甲基纖維素培養(yǎng)系統(tǒng)（methylcellulose culture system，MCS）可作為生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)的另一種三維培養(yǎng)法，該系統(tǒng)允許小鼠減數(shù)分裂前的雄性生殖細(xì)胞在體外通過(guò)減數(shù)分裂成熟為形態(tài)正常的精子。2015年Huleihel等[20]用取自恒河猴（一種高度進(jìn)化的靈長(zhǎng)類動(dòng)物）的SSCs在三維甲基纖維素系統(tǒng)（由42%的甲基纖維素組成）中培養(yǎng)，表明MCS三維培養(yǎng)系統(tǒng)可以提供有助于SSCs增殖分化至關(guān)重要的元素。2018年Abofoul-Azab等[21]首次在經(jīng)歷放射治療的青春期前癌癥患者的睪丸中分離出具有生物活性的SSCs，發(fā)現(xiàn)SSCs在體外MCS三維培養(yǎng)中可以增殖，并且向不同的精子形成階段分化（如減數(shù)分裂中或者減數(shù)分裂后），最終成功分化出單倍體精子樣細(xì)胞，此發(fā)現(xiàn)可能為青春期前癌癥男孩的生育保護(hù)和無(wú)精子癥患者的新治療策略提供思路。2019年又有研究首次從無(wú)精子的睪丸唯支持細(xì)胞綜合征患者活檢睪丸組織中分離出SSCs，并在體外MCS三維培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)SSCs發(fā)生減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后變化[4]。此研究一方面表明，睪丸唯支持細(xì)胞綜合征患者無(wú)法在體內(nèi)完成精子形成可能與睪丸微環(huán)境和支持細(xì)胞功能受損有關(guān)，另一方面也證明甲基纖維素三維培養(yǎng)系統(tǒng)可以提供一種近似體內(nèi)微環(huán)境的培養(yǎng)條件。相比膠原作為培養(yǎng)基質(zhì)，MCS的使用使我們有更多機(jī)會(huì)從三維基質(zhì)中提取培養(yǎng)細(xì)胞，隨后使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行更詳細(xì)的分析，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的評(píng)價(jià)可以進(jìn)一步驗(yàn)證分子、形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)等方法對(duì)細(xì)胞的分析結(jié)果[18]。

3.3 納米纖維支架三維培養(yǎng)法 納米纖維基質(zhì)可以模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的結(jié)構(gòu)和功能，其支架為SSCs提供更好的三維空間、生物模擬和信號(hào)傳遞，納米纖維支架三維培養(yǎng)系統(tǒng)可用于再生醫(yī)學(xué)、組織工程、輔助生殖技術(shù)以及治療青春期前癌癥患者的不育癥[9]。納米纖維支架的特性（例如纖維排列，纖維直徑和孔徑，以及機(jī)械性能）都可以被調(diào)節(jié)以高度模擬體內(nèi)特定部位微環(huán)境。相比無(wú)支架體外培養(yǎng)，納米纖維支架的多孔結(jié)構(gòu)（＞80%～95%）有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和廢物的大規(guī)模運(yùn)輸和交換，進(jìn)而更有利于SSCs的體外培養(yǎng)。此外，在較長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)基的交換相對(duì)容易，而且納米纖維支架也可以被不同的活性化合物（如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白）包覆，以滿足目標(biāo)實(shí)驗(yàn)需要[22-23]。2013年Eslahi等[24]研究了未成熟小鼠凍融的SSCs和凍融睪丸組織碎片在聚L乳酸（PLLA）納米纖維支架中的培養(yǎng)情況，3周后精原性標(biāo)記基因（Itgα6、Itgβ1、PLZF和Oct4）的表達(dá)得以維持，PLLA納米纖維支架上新鮮和凍融的SSCs的增殖明顯增加；此外，在納米纖維上培養(yǎng)的凍融細(xì)胞中某些精原特異基因的表達(dá)明顯減少以及精原細(xì)胞分化標(biāo)記基因（c-Kit）的表達(dá)增加，說(shuō)明納米纖維支架也可以用于SSCs的分化。體外培養(yǎng)中使用的另一種納米纖維支架是聚酰胺納米絲狀物，其是由不規(guī)則的靜電紡絲制成，其結(jié)構(gòu)與基膜相似，為細(xì)胞聚集創(chuàng)造了更好的條件[25]。Shakeri等[26]報(bào)道了在體外培養(yǎng)過(guò)程中，由靜電紡聚酰胺納米絲狀物組成的三維納米纖維基質(zhì)對(duì)從6日大的小鼠睪丸中獲取的SSCs增殖分化以及功能的影響。在納米纖維表面培養(yǎng)7 d后，SSCs細(xì)胞團(tuán)數(shù)量、每個(gè)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞團(tuán)的平均面積均有所增加（P＜0.05）。此研究發(fā)現(xiàn)納米纖維為支持細(xì)胞維持其旁分泌提供更好的微環(huán)境，并且可以影響SSC的增殖和分化。2020年Ziloochi等[27]在研究瓊脂/聚乙烯醇納米纖維（PVA）支架對(duì)新生兒睪丸SCCs增殖效率和分化潛能的影響中發(fā)現(xiàn)，瓊脂/PVA支架與生長(zhǎng)因子補(bǔ)充的培養(yǎng)基相結(jié)合協(xié)同增加了小鼠SSCs向精母細(xì)胞和減數(shù)分裂后細(xì)胞的分化率。因此，瓊脂/PVA納米纖維支架在修復(fù)不育特別是無(wú)精子男性不育方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3.4 脫細(xì)胞生物支架三維培養(yǎng)法 脫細(xì)胞是用于組織工程的一種常用方法[28]，為了保護(hù)組織的調(diào)節(jié)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，模擬器官功能，可以使用酶、化學(xué)、物理或這些方法的結(jié)合去除目標(biāo)組織的細(xì)胞和DNA。組織工程的主要成分是支架（又稱細(xì)胞外基質(zhì)），細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等可以在支架中組合使用[28]。值得注意的是，脫細(xì)胞支架比人工合成支架（如軟瓊脂、甲基纖維素、納米纖維素等三維培養(yǎng)法）具有更好的結(jié)構(gòu)和生化性能，這些特點(diǎn)可以更好地支持細(xì)胞遷移、增殖、分化、組織形成以及蛋白表達(dá)[29]。2018年Vermeulen等[30]將豬的未成熟睪丸組織（ITT）用不同的方案進(jìn)行脫細(xì)胞處理以產(chǎn)生細(xì)胞相容性支架，蘇木精伊紅染色顯示，在所有脫細(xì)胞組織中，睪丸結(jié)構(gòu)保存完好，空的生精小管清晰可辨，免疫組化發(fā)現(xiàn)所有脫細(xì)胞方案后ECM相關(guān)蛋白同樣保存完好，與不使用支架培養(yǎng)的干細(xì)胞相比，使用支架培養(yǎng)的干細(xì)胞增殖率更高，干細(xì)胞因子分泌量也更大。但是該研究沒(méi)有此培養(yǎng)條件下SSCs的分化情況。2019年Vermeulen等[31]再次對(duì)豬低溫保存ITT進(jìn)行脫細(xì)胞處理開(kāi)發(fā)水凝膠來(lái)創(chuàng)建睪丸類器官，發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞ITT開(kāi)發(fā)的睪丸類器官中生長(zhǎng)因子保存較好，因此具有較好的恢復(fù)生殖能力的潛力。2020年Majidi Gharenaz等[32]用脫細(xì)胞小鼠全睪丸作為培養(yǎng)SSCs的天然三維支架，此支架經(jīng)注射SSCs后被重新細(xì)胞化，培養(yǎng)8周對(duì)細(xì)胞化支架進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，注射的SSCs固定在生精小管基底膜上，實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析顯示SSCs發(fā)生減數(shù)分裂，表明SSCs注入脫細(xì)胞睪丸支架后可增殖分化為精母細(xì)胞，但是培養(yǎng)8周后并未發(fā)現(xiàn)圓形精子，提示SSCs并沒(méi)有完成產(chǎn)生功能性精子的全過(guò)程。

4 三維培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)和不足

4.1 三維培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn) ①高度模擬體內(nèi)SSCs壁龕微環(huán)境，加深對(duì)生殖細(xì)胞與體細(xì)胞之間以及生殖細(xì)胞與ECM之間相互作用的認(rèn)識(shí)，摸索SSCs體外增殖、分化所需要的最佳時(shí)間和空間條件。②體外精子發(fā)生三維培養(yǎng)體系的建立也將使一些在體內(nèi)難以直接進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)成為可能，如新藥或潛在毒物對(duì)人類精子發(fā)生的藥學(xué)或毒理學(xué)研究。③人類單倍體男性生殖細(xì)胞的體外成功產(chǎn)生，將為那些因癌癥治療面臨不育的青春期前癌癥患者，或者其他原因造成的成年男性不育患者保留生育能力帶來(lái)希望。

4.2 三維培養(yǎng)法的不足 ①用于確定SSC干細(xì)胞特性的標(biāo)記物不統(tǒng)一。②SSCs分化產(chǎn)生的精子數(shù)量較少。③不能直接檢測(cè)精子活力，無(wú)法確定受精能力。④軟瓊脂培養(yǎng)系統(tǒng)難以從凝膠中回收細(xì)胞，脫細(xì)胞生物支架培養(yǎng)系統(tǒng)仍需優(yōu)化脫細(xì)胞方案避免對(duì)ECM造成損傷。

5 結(jié)語(yǔ)

精原干細(xì)胞三維體外培養(yǎng)法的不斷改進(jìn)對(duì)研究精子發(fā)生相關(guān)分子機(jī)制、臨床治療及再生醫(yī)學(xué)具有重要價(jià)值。相比軟瓊脂培養(yǎng)法存在細(xì)胞間相互作用丟失的可能，甲基纖維素培養(yǎng)法可以相對(duì)簡(jiǎn)單的獲取培養(yǎng)細(xì)胞，納米纖維素培養(yǎng)法便于更換培養(yǎng)基、相對(duì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，脫細(xì)胞天然三維培養(yǎng)方法更貼合體內(nèi)微環(huán)境。然而SSCs三維體外培養(yǎng)法仍較多地應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，許多問(wèn)題亟待解決，例如：SSCs樣本獲取有限、體外分化效率低、不能有效檢測(cè)生殖細(xì)胞活性等問(wèn)題，以及尚未明確人類生殖細(xì)胞發(fā)育的適用性和精子產(chǎn)生后代的功能。因此，積極解決上述問(wèn)題將成為男性生殖及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新的研究重點(diǎn)。