鄧芮 符筱 孫劍

全球約有2.57億慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者，慢性乙型肝炎(CHB)又是導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌(HCC)和肝臟相關(guān)死亡的主要因素，防治HBV感染已成為全球公共衛(wèi)生問題。由于聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)和核苷(酸)類似物(NAs)均可抑制HBV復(fù)制并延緩疾病進(jìn)展，目前這兩種藥物已被批準(zhǔn)用于CHB的治療。然而，在現(xiàn)有治療下，CHB患者通常難以實(shí)現(xiàn)完全治愈[1-2]。通常認(rèn)為，CHB患者理想的治療終點(diǎn)是乙型肝炎表面抗原(HBsAg)持續(xù)檢測不到，伴或不伴HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，因?yàn)楹笳咭馕吨颊邔BV產(chǎn)生了免疫力，預(yù)后良好[3]。然而，由于肝內(nèi)共價閉合環(huán)狀HBV DNA(cccDNA)持續(xù)存在，CHB患者很少發(fā)生HBsAg清除和血清學(xué)轉(zhuǎn)換。雖然有報(bào)道部分CHB患者可自發(fā)實(shí)現(xiàn)HBsAg清除和血清學(xué)轉(zhuǎn)換，但其發(fā)生率并不確切，因?yàn)樗艿蕉喾N患者特征如年齡、肝硬化、HBeAg狀態(tài)、HBV DNA水平和血清HBsAg水平等的影響[4-5]。既往研究表明，HBsAg清除的年發(fā)生率從0.12%到2.38%不等[4, 6]。宿主對HBV的免疫應(yīng)答與HBV感染的自然史密切相關(guān)，CHB的發(fā)病則與T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫應(yīng)答耗竭有關(guān)，而HBsAg在該免疫致病過程中也發(fā)揮著重要作用。因此，本文著重概述在當(dāng)前治療下血清HBsAg清除的現(xiàn)狀，并為開發(fā)能有效清除HBsAg的新療法提供線索，幫助CHB患者早日實(shí)現(xiàn)治愈。

一、血清HBsAg的來源和檢測

完整的HBV顆粒結(jié)構(gòu)包括內(nèi)層的核衣殼及外層的包膜，其中包膜由大、中、小三種外膜蛋白所組成，即L-HBsAg、M-HBsAg和S-HBsAg。L-HBsAg(PreS1結(jié)構(gòu)域)N端的75個氨基酸與HBV受體(人?；悄懰徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽受體，hNTCP)的157至165個殘基之間的親和力高，在病毒附著并感染肝細(xì)胞的過程中起著至關(guān)重要的作用。HBV侵入肝細(xì)胞后，在細(xì)胞質(zhì)中脫去HBsAg，核衣殼進(jìn)入感染細(xì)胞的胞核內(nèi)，其中包含的松弛環(huán)狀部分雙鏈DNA(rcDNA)隨后被補(bǔ)齊并轉(zhuǎn)化為cccDNA。cccDNA以微型染色體的形式存在于感染肝細(xì)胞的胞核內(nèi)，是HBV復(fù)制轉(zhuǎn)錄并翻譯成HBsAg等病毒蛋白的模板。因此，血清中HBsAg的定量水平可在一定程度上反映cccDNA的轉(zhuǎn)錄情況，從而可用作療效評價的臨床指標(biāo)。目前，隨著高靈敏度和特異性的HBsAg檢測方法推出市場，HBsAg水平在疾病進(jìn)展及復(fù)發(fā)風(fēng)險分層和治療應(yīng)答預(yù)測等方面的價值重新受到了關(guān)注。但值得注意的是，cccDNA并不是HBsAg的唯一來源，宿主基因組中的HBV DNA整合片段同樣可以產(chǎn)生HBsAg[7]。因此，即使阻斷HBV cccDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，也不能完全抑制HBsAg的產(chǎn)生。

二、血清HBsAg的清除：發(fā)生率和臨床意義

慢性HBV感染的自然史有五個不同階段[1]：第一階段為HBeAg陽性的慢性HBV感染，表現(xiàn)為HBeAg陽性、HBV DNA高水平但丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平正常；第二階段是HBeAg陽性的CHB，表現(xiàn)為HBV DNA和ALT高水平，伴有中重度肝臟炎癥壞死，大多數(shù)患者可發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，從而進(jìn)入HBeAg陰性的慢性HBV感染的第三階段。本期患者抗-HBe陽性，HBV DNA < 2 000 IU/mL或檢測不到，ALT水平正常，在此階段病毒基因最有可能整合到宿主基因組中，血清HBsAg仍為陽性；一些患者則發(fā)展到第四階段，即HBeAg陰性的CHB(再激活期)，特征為HBeAg轉(zhuǎn)陰，但血清HBV DNA和ALT均處于中高水平；而第五階段則為HBsAg陰性階段，特征在于血清HBsAg陰性，伴或不伴抗-HBs出現(xiàn)。

值得注意的是，自發(fā)性HBsAg清除的定義為間隔至少6個月兩次檢測血清HBsAg一直保持陰性，其在CHB感染自然史中很罕見，且通常發(fā)生在處于非活動期至少10年的患者中[8]。一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示，世界范圍內(nèi)自發(fā)性HBsAg清除的年發(fā)生率為1%～2%[9]。血清HBsAg清除率與感染時的年齡以及基線時HBV DNA和HBsAg的水平均有關(guān)。圍產(chǎn)期感染HBV的患者其血清HBsAg清除率要低于成年后感染者，而基線HBV DNA水平較低和HBsAg水平較低的患者發(fā)生HBsAg清除的概率更高。此外，與HBsAg持續(xù)陽性的攜帶者相比，獲得HBsAg清除者發(fā)生HCC的風(fēng)險顯著降低[10-11]。但是，尚無充分證據(jù)支持HBsAg清除率與性別、HBV基因型或治療史有關(guān)。

三、HBsAg和免疫系統(tǒng)

一方面，當(dāng)宿主受到HBV攻擊時，機(jī)體免疫系統(tǒng)啟動免疫防御，免疫細(xì)胞激活，分泌大量的細(xì)胞因子，抑制HBV感染并清除HBsAg。多種先天性和獲得性免疫細(xì)胞，如自然殺傷(NK)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCs)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞以及漿細(xì)胞等均參與了此復(fù)雜的調(diào)控過程。除外周血中循環(huán)的免疫細(xì)胞外，肝臟駐留的免疫細(xì)胞同樣在早期免疫監(jiān)視方面發(fā)揮著重要作用。但是，血清HBsAg清除的免疫機(jī)制尚未詳細(xì)闡明。

另一方面，當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)對抗HBV感染的過程出現(xiàn)動態(tài)失衡，產(chǎn)生肝臟慢性炎癥和壞死，表現(xiàn)為CHB。慢性HBV感染可抑制外周免疫細(xì)胞及肝細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并使得抗病毒細(xì)胞因子的分泌減少，而HBsAg與該免疫逃逸過程密切相關(guān)。首先，HBsAg可干擾固有免疫信號通路，抑制多種固有免疫細(xì)胞的激活，如HBsAg持續(xù)陽性的CHB患者外周血和肝臟中DCs的增殖和分化成熟受到抑制，其表面的Toll樣受體表達(dá)下調(diào)且相應(yīng)信號通路也受影響。此外，持續(xù)表達(dá)的HBsAg還會降低機(jī)體NK細(xì)胞的數(shù)目及細(xì)胞的殺傷能力。除了對機(jī)體固有免疫有抑制作用外，HBsAg還與獲得性免疫細(xì)胞(包括T細(xì)胞及B細(xì)胞)的數(shù)目減少及功能耗竭有關(guān)。

四、當(dāng)前療法下HBsAg清除的現(xiàn)狀

CHB的治療目標(biāo)是減少終末期肝病和HCC的發(fā)生，延長患者生存時間和改善患者生活質(zhì)量。血清HBsAg清除與肝臟功能及長期預(yù)后改善相關(guān)，是目前推薦的理想治療終點(diǎn)，也可作為評估患者生存改善的替代指標(biāo)[3]。目前指南推薦的CHB治療方法主要包括PEG-IFN和NAs，前者有免疫調(diào)節(jié)和直接抗病毒雙重作用，后者則直接抑制病毒聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄功能，單藥治療即可有效抑制HBV復(fù)制，但兩種療法在清除HBsAg方面的療效均有限。PEG-IFN應(yīng)用一定療程(通常是48周)后可誘導(dǎo)持續(xù)應(yīng)答，但其局限性在于患者的應(yīng)答率低且耐受性較差；而口服NAs藥物雖抗病毒效力高且患者耐受性好，但由于無法清除感染肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA，患者通常需要長期甚至終生用藥。目前一線的口服抗病毒藥物主要包括恩替卡韋(ETV)、替諾福韋二吡呋酯(TDF)和替諾福韋艾拉酚胺(TAF)。

(一)IFN治療下的HBsAg清除 既往研究表明，PEG-IFN治療48周可促進(jìn)機(jī)體對HBV的免疫控制，單用PEG-IFN治療的患者HBsAg清除率要比拉米夫定單藥治療者更高[12-13]。同時，在停用PEG-IFN治療后，患者仍可維持病毒抑制狀態(tài)，并有部分DNA持續(xù)檢測不到的患者(持續(xù)應(yīng)答者)可維持長期HBsAg陰性。

(二)NAs治療下的HBsAg清除 NAs作為口服抗病毒藥物，主要以耐受性好、療效佳著稱。其中ETV和TDF用藥后95%以上的患者可實(shí)現(xiàn)病毒轉(zhuǎn)陰，且耐藥屏障高。對HBeAg陽性CHB患者HBsAg動態(tài)變化的觀察顯示[14]，TDF治療5年后的HBsAg清除率約為10%，并且在白人患者中更常發(fā)生HBsAg清除。與TDF單藥或單用PEG-IFN治療的患者相比，TDF聯(lián)合48周PEG-IFN治療的患者其HBsAg清除率要更高，且主要發(fā)生于基因型A的HBV感染者中[15]。但聯(lián)合治療下HBsAg清除的持久性尚未明確，仍需要對聯(lián)合治療后實(shí)現(xiàn)了HBsAg清除的患者進(jìn)行長期隨訪，制定出最佳的聯(lián)合治療方案，幫助更多的CHB患者實(shí)現(xiàn)并維持HBsAg清除。

(三)HBsAg下降預(yù)測PEG-IFN治療應(yīng)答 現(xiàn)有療法對血清HBsAg清除具有一定作用，同時血清HBsAg水平下降也可以預(yù)測PEG-IFN治療結(jié)束后的持續(xù)應(yīng)答情況，因而在治療早期即可識別出應(yīng)答者。一項(xiàng)納入了48例PEG-IFN-2α治療的HBeAg陰性患者的研究表明[16]，治療第12周HBsAg水平降低0.5 log10 IU/mL對持續(xù)應(yīng)答的陰性預(yù)測值為90%，陽性預(yù)測值為89%；當(dāng)治療到第24周，HBsAg水平降低1 log10 IU/mL的相應(yīng)陰性預(yù)測值為97%，陽性預(yù)測值則為92%。這項(xiàng)研究首次揭示，監(jiān)測PEG-IFN治療早期(12周內(nèi))患者的血清HBsAg水平有助于區(qū)分持續(xù)應(yīng)答者和無應(yīng)答者。

(四)HBsAg定量預(yù)測NAs停藥后應(yīng)答情況 近年來，研究者開始關(guān)注NAs停藥對HBsAg清除的作用[17-18]。但在設(shè)計(jì)NAs停藥研究時，除了關(guān)注停藥后的HBsAg清除率，NAs停藥后的復(fù)發(fā)風(fēng)險也不容忽視。因此需要尋找停藥時的病毒相關(guān)指標(biāo)對NAs停藥后的應(yīng)答情況進(jìn)行預(yù)測，以確定最佳停藥時機(jī)。一項(xiàng)針對亞洲CHB患者的系統(tǒng)綜述報(bào)道[19]，停藥時的HBsAg水平對于NAs停藥后的應(yīng)答情況(包括停藥后復(fù)發(fā)風(fēng)險及停藥后HBsAg清除)有一定預(yù)測作用，HBsAg定量<100 IU/mL可能代表較好的停藥時機(jī)。一方面，對HBeAg陰性的亞洲CHB患者進(jìn)行停藥并隨訪39個月，發(fā)現(xiàn)停藥時HBsAg定量水平分別處于< 100 IU/mL、100～200 IU/mL、100～500 IU/mL、> 500 IU/mL和> 1000 IU/mL這5個范圍的患者HBsAg清除率分別為21.1%～58.8%、25.5%、4.4%、2.3%和0.0%。另一方面，停藥時HBsAg水平<100 IU/mL的患者停藥1年后的病毒學(xué)復(fù)發(fā)率明顯要低于停藥時HBsAg定量> 100 IU/mL的患者，前者復(fù)發(fā)率僅為9.1%～19.6%，可認(rèn)為在該前提下對符合條件的患者進(jìn)行停藥較為安全。

此外，為進(jìn)一步明確NAs停藥能否促進(jìn)HBsAg清除，我們中心正在開展一項(xiàng)以經(jīng)過NAs治療達(dá)到HBsAg定量≤200 IU/mL的CHB患者為研究對象，基于新型病毒學(xué)指標(biāo)(HBV RNA或HBcrAg)指導(dǎo)停藥的前瞻性隨機(jī)對照研究，希望通過該研究獲取有關(guān)HBsAg清除的新證據(jù)，幫助更多的CHB患者實(shí)現(xiàn)臨床治愈。

(五)新型療法下HBsAg清除的前景 目前研究者們?nèi)栽谔剿餍碌腃HB治療策略，包括研發(fā)針對HBV復(fù)制周期各個階段的抗病毒藥物(如病毒進(jìn)入、病毒復(fù)制、cccDNA產(chǎn)生和病毒蛋白釋放等相關(guān)抑制劑)，同時也包括各種免疫調(diào)節(jié)類藥物[20]。這些新藥均可作為現(xiàn)有PEG-IFN和NAs療法的補(bǔ)充，有望能幫助CHB患者早日徹底清除血清HBsAg，實(shí)現(xiàn)臨床治愈。通過抑制cccDNA的轉(zhuǎn)錄或病毒mRNA的翻譯，HBV的基因表達(dá)受到抑制，血清HBsAg的水平將得以下降。目前靶向HBsAg的藥物主要有三大類，第一類主要直接抑制HBsAg的釋放，第二類通過促進(jìn)HBV cccDNA清除或功能性沉默以減少HBsAg的產(chǎn)生，第三類則通過小干擾RNA下調(diào)HBsAg的表達(dá)。其中，核酸聚合物(NAPs)是一類新型的廣譜抗病毒化合物，可通過阻斷受感染的肝細(xì)胞釋放HBsAg來抑制HBV感染。此外，NAPs阻斷了血清中HBsAg的補(bǔ)充，可以增強(qiáng)免疫治療(如PEG-IFN)的療效，有助于促進(jìn)宿主免疫介導(dǎo)的病毒清除，具有重要的臨床意義。目前，已有部分NAPs(如REP 2139、REP 2055和REP 2165等)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段，評估其在單藥治療和聯(lián)合治療中的效果。結(jié)果顯示NAPs對HBsAg清除的作用強(qiáng)，且安全性良好，但有關(guān)HBsAg會否在細(xì)胞內(nèi)潴留而具有潛在細(xì)胞毒性以及NAPs在肝臟中蓄積的問題仍需進(jìn)一步觀察和研究。

血清HBsAg清除對CHB患者十分重要，可降低HCC發(fā)生風(fēng)險，但在HBV感染自然史中尤為罕見。目前應(yīng)用PEG-IFN和NAs抗病毒治療可抑制HBV復(fù)制，改善CHB患者的預(yù)后，但并不能完全清除HBsAg。研究表明，HBsAg可導(dǎo)致先天性和獲得性免疫功能受損，T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答耗竭，因此降低血清HBsAg水平有助于恢復(fù)宿主的免疫系統(tǒng)，但HBsAg清除的免疫學(xué)機(jī)制尚不清楚。由于感染的肝細(xì)胞內(nèi)存在持續(xù)表達(dá)HBsAg的cccDNA和整合的HBV DNA，加上慢性HBV感染導(dǎo)致肝臟微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)，徹底清除HBV仍面臨著重大的挑戰(zhàn)。通過直接抑制HBsAg的生成和釋放、促進(jìn)HBV cccDNA的清除或功能性沉默等均可降低HBsAg水平，針對病毒的特異性免疫應(yīng)答也將得以恢復(fù)。未來對抗病毒藥物及免疫調(diào)節(jié)類藥物的研發(fā)也仍需繼續(xù)關(guān)注其清除HBsAg的能力，開發(fā)高效靶向HBsAg的聯(lián)合療法可進(jìn)一步誘導(dǎo)抗HBV特異性免疫應(yīng)答，并最終實(shí)現(xiàn)CHB的功能性治愈。