劉軒卓

摘? 要：熒光蛋白（Fluorescentprotein）的分離應(yīng)用為現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用，其是一類可在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生熒光的發(fā)光蛋白，較為常見的有綠色熒光蛋白（Greenfluorescentprotein，簡(jiǎn)稱GFP）、藍(lán)色熒光蛋白（Bluefluorescentprotein，簡(jiǎn)稱BFP）、青色熒光蛋白（Cyanfluorescentprotein，簡(jiǎn)稱CFP）、黃色熒光蛋白（Yellowfluorescentprotein，簡(jiǎn)稱YFP）、紅色熒光蛋白（Redfluorescentprotein，簡(jiǎn)稱RFP）等。熒光蛋白的熒光穩(wěn)定性較好，而且靈敏度很高，因此應(yīng)用較為廣泛，尤其是在生物學(xué)的眾多領(lǐng)域都有應(yīng)用。本文將從熒光蛋白的基礎(chǔ)理論、在微生物過(guò)程工程中的應(yīng)用現(xiàn)狀包括應(yīng)用范圍、應(yīng)用方法以及未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)等方面做綜述，為后續(xù)熒光蛋白更加廣泛的應(yīng)用提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：熒光蛋白? 微生物? 過(guò)程工程? 應(yīng)用研究

中圖分類號(hào)：Q93? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：1674-098X（2020）08（b）-0091-03

Abstract： Fluorescent protein separation application plays a vital role for the development of modern industry. It is a kind of Fluorescent protein that can produce fluorescence under UV excitation. More common are Green fluorescent protein （GFP）， Blue fluorescent protein （BFP）， Cyan fluorescent protein （CFP）， Yellow fluorescent protein （YFP）， Red fluorescent protein Protein （RFP）， etc. Fluorescent proteins have good fluorescence stability and high sensitivity， so they are widely used， especially in many fields of biology. In this paper， the basic theory of fluorescent protein， the application status in microbial process engineering， including the application scope， application methods and future development trend will be reviewed， so as to provide some references for more extensive application of fluorescent protein in the future.

Key Words： Fluorescent protein; Microbes; Process engineering; Application research

熒光蛋白最初于1992年自水母體內(nèi)克隆而來(lái)，其熒光特質(zhì)可以有效地揭示生物分子的運(yùn)動(dòng)規(guī)律及其基因本質(zhì)，借助此特性可應(yīng)用于基因的表達(dá)調(diào)控、生物分子相互作用、蛋白質(zhì)中蛋白折疊、蛋白間信號(hào)傳導(dǎo)以及各種生物蛋白酶活性分析等[1]。目前已經(jīng)分離出的熒光蛋白分布于整個(gè)可見光區(qū)，主要有綠色、藍(lán)色、青色、黃色以及紅色熒光蛋白[2]。每種熒光蛋白的應(yīng)用特性各有不同，可應(yīng)用于目的細(xì)胞的篩選、細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)表征等方面。

1? 熒光蛋白

熒光蛋白的應(yīng)用由來(lái)已久，其應(yīng)用屬性主要集中在熒光蛋白的亮度、Stokes位移（激發(fā)峰與發(fā)射峰之間的距離）、光譜特性的優(yōu)化、新型光轉(zhuǎn)換與光激活熒光蛋白等方面[3]。綠色熒光蛋白是最早分離出的熒光蛋白，在波長(zhǎng)300～500nm的激光激發(fā)下可發(fā)出綠色熒光。其在水母中發(fā)現(xiàn)，水母素在鈣刺激下發(fā)光，其能量可轉(zhuǎn)移到GFP，刺激GFP發(fā)光。由于其生色團(tuán)的形成沒有物種特異性，易于引發(fā)突變，且對(duì)于pH值較為敏感，易形成對(duì)應(yīng)的二聚體，從而拓寬其應(yīng)用價(jià)值[4]。青色熒光蛋白其熒光屬性僅次于綠色熒光蛋白。藍(lán)色熒光蛋白分離于野生珊瑚，其熒光量子產(chǎn)率較低，穿透力較弱且容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害，應(yīng)用較少。黃色熒光蛋白相對(duì)穿透力較強(qiáng)，可應(yīng)用于成像方面。紅色熒光蛋白可與橙色熒光蛋白配對(duì)使用從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的雙成像，使得兩種分子事件可以同步實(shí)現(xiàn)。熒光是熒光蛋白最特別的特點(diǎn)，而其中的發(fā)色團(tuán)起著主要的作用。在α-螺旋上的65、66、67位氨基酸——絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸經(jīng)過(guò)環(huán)化、脫氫等作用后形成發(fā)色團(tuán)。有意思的是，發(fā)色團(tuán)形成過(guò)程是由外周柵欄上的殘基催化，底物只需要氧氣。這暗示綠色熒光蛋白被廣泛用于不同物種的潛力：在不同物種中能獨(dú)立表達(dá)成有功能的蛋白，而不需要額外的因子。

2? 熒光蛋白應(yīng)用于目的細(xì)胞篩選

熒光蛋白主要的應(yīng)用是微生物的篩選。熒光蛋白與熒光素/熒光素酶不同，無(wú)需任何輔助因子，只需藍(lán)光照射便能自發(fā)光，而且傳統(tǒng)熒光因子發(fā)光時(shí)會(huì)產(chǎn)生光毒性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而熒光蛋白毒性較弱，適合標(biāo)記活體細(xì)胞及組織。與目的基因組成融合蛋白或通過(guò)IRES或2A與感興趣的蛋白共表達(dá)，可將熒光蛋白定位到特定的細(xì)胞器或膜系統(tǒng)中。將熒光蛋白基因連接到目的基因啟動(dòng)子之后，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度便可對(duì)該基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。或者，將熒光蛋白作為標(biāo)簽與主體蛋白融合，可檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的定位、遷移、構(gòu)象變化以及分子間的相互作用，這也是熒光蛋白最成功的應(yīng)用之一。而在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)的應(yīng)用中，綠色螢光蛋白（GFP）基因常用做報(bào)告基因（reportergene）。綠色螢光蛋白基因也可以克隆到脊椎動(dòng)物（例如：兔子）上進(jìn)行表現(xiàn)，并拿來(lái)映證某種假設(shè)的實(shí)驗(yàn)方法。通過(guò)基因工程技術(shù)，綠色螢光蛋白（GFP）基因能轉(zhuǎn)進(jìn)不同物種的基因組，在后代中持續(xù)表達(dá)。生物育種篩選使用DNA重組以及改組技術(shù)已經(jīng)日漸成熟，通過(guò)編輯篩選從而取得具有特定目的的基因，實(shí)現(xiàn)一定功能。熒光蛋白基因片段較短，因此在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)配錯(cuò)幾率小，比傳統(tǒng)的方法更加快速有效[5]。

3? 熒光蛋白應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)表征

細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)與其蛋白質(zhì)構(gòu)象密切相關(guān)，明確蛋白質(zhì)的構(gòu)象就可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)有清晰的認(rèn)識(shí)。如部分科學(xué)家通過(guò)篩選和建立模型，可以有效篩選出錯(cuò)誤基因，構(gòu)建出基因表達(dá)路徑及對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)，從而有效阻止蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，讓細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)狀態(tài)正確表達(dá)。如紅色熒光蛋白其生色團(tuán)發(fā)光較為明顯，可以通過(guò)對(duì)目標(biāo)蛋白的融合而顯示出對(duì)應(yīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白的結(jié)構(gòu)是否錯(cuò)誤折疊。綠色熒光蛋白對(duì)于pH值較為敏感，可以將綠色熒光蛋白植入需觀察的細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)其熒光變化從而監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)的pH變化，為其他研究奠定基礎(chǔ)。

4? 熒光蛋白應(yīng)用方法

熒光蛋白的應(yīng)用日漸廣泛，如何正確且高效的選用對(duì)應(yīng)蛋白至關(guān)重要。如熒光蛋白與目標(biāo)蛋白的融合表達(dá)受其單體性質(zhì)影響，若想直接地追蹤目標(biāo)蛋白或是定位目標(biāo)蛋白，則要求熒光蛋白是單體，不能影響目標(biāo)蛋白的功能和定位，此時(shí)將熒光蛋白的單體性質(zhì)放在首位。當(dāng)前體外檢測(cè)熒光蛋白單體性質(zhì)的方法有分子篩法、沉降平衡法等，可以通過(guò)熒光蛋白分子篩的峰圖是否狹窄，單一粗略的判斷其是否為單體，而沉降平衡法能夠更加準(zhǔn)確地確認(rèn)其聚合性質(zhì)。熒光蛋白的使用幾乎都是在細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)，在生理?xiàng)l件下熒光蛋白的聚合性質(zhì)關(guān)系到目的細(xì)胞篩選的成功與否。在選擇熒光蛋白時(shí)，還要考慮目標(biāo)蛋白定位環(huán)境的pH值，再考慮使用相應(yīng)的熒光蛋白[6]。此外，熒光蛋白在發(fā)光之前需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊等步驟，其中折疊過(guò)程占據(jù)了大部分時(shí)間，此過(guò)程稱之為成熟時(shí)間。在標(biāo)記短壽命的目標(biāo)蛋白時(shí)，如果熒光蛋白的成熟時(shí)間太長(zhǎng)，可能會(huì)出現(xiàn)在目標(biāo)蛋白開始降解時(shí)，熒光蛋白還沒有發(fā)光，導(dǎo)致無(wú)法追蹤及定位目標(biāo)蛋白。因此在選擇熒光蛋白時(shí)，亦需要考慮其成熟時(shí)間。

5? 討論與展望

當(dāng)微生物研究深入至分子學(xué)領(lǐng)域時(shí)，可以通過(guò)改良基因，篩選特定基因等方法優(yōu)化熒光蛋白的應(yīng)用。如通過(guò)檢測(cè)植物病原菌內(nèi)部的基因表達(dá)，研究進(jìn)行抗病基因如何表達(dá)，熒光蛋白起表達(dá)作用。通過(guò)實(shí)時(shí)顯示病原菌與植物的相互作用，從而研究出對(duì)應(yīng)的抗病菌類。目前各類熒光蛋白的研究應(yīng)用較為深入，根據(jù)不同熒光蛋白的特性，其對(duì)應(yīng)的研究領(lǐng)域已基本明了，并取得了一定的成果。但是在活體成像、蛋白間相互作用等研究方面仍有一定的發(fā)展空間。而且由于熒光蛋白能穩(wěn)定在后代遺傳，并且能根據(jù)啟動(dòng)子特異性地表達(dá)，在需要定量或其他實(shí)驗(yàn)中慢慢取代了傳統(tǒng)的化學(xué)染料。更多的熒光蛋白被改造成了不同的新工具，既提供了解決問(wèn)題的新思路，也可能帶來(lái)更多有價(jià)值的新問(wèn)題。細(xì)胞篩選現(xiàn)處于研究成果多發(fā)階段，熒光蛋白的應(yīng)用具有深遠(yuǎn)的發(fā)展前景，但同時(shí)存在一定的局限性。

參考文獻(xiàn)

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[3] 劉春，陳曉虹，姜蘭，等.鮰愛德華氏菌的紅色熒光蛋白標(biāo)記及其應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，35（3）：661-666.DOI：10.3969/j.issn.1000-4440.2019.03.022.

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