張?zhí)?，劉艷全，丁真真，努爾馬木提·買買提江，龔國利

(1.喀什大學 生命與地理科學學院，新疆 喀什 844000； 2.陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

乳酸菌是一類微需氧、厭氧或兼性厭氧的，能夠發(fā)酵糖類產(chǎn)酸的一類革蘭氏陽性菌，細胞形態(tài)為桿狀或球狀[1,2]，乳酸菌種類繁多，因其較高的營養(yǎng)價值而被廣泛應(yīng)用于保健食品、嬰幼兒食品和飼料中。如自然發(fā)酵的泡菜、混菌發(fā)酵的乳制品(發(fā)酵乳飲料、酸奶、干酪等)和青貯飼料，乳酸菌都是必不可少的菌種[3]。乳酸菌是人和動物腸道中的有益菌群，大量的動物試驗和臨床試驗證明發(fā)酵產(chǎn)品能夠改善乳糖不耐癥，而有些乳酸菌可粘附在機體腸道中，形成生理屏障，抵御有害菌，預(yù)防食物過敏，促進腸道蠕動，幫助機體消化，調(diào)節(jié)機體免疫功能，降低膽固醇，降血壓等。在食品的乳酸菌發(fā)酵過程中，乳酸菌生成的乳酸、醋酸等有機酸及醇類等可抑制有害物質(zhì)的生成，提高食品的保鮮度，大大提高食品的營養(yǎng)價值，容易消化吸收，有益于老人和兒童食用[4]。

本研究以喀什市、疏勒縣、疏附縣的傳統(tǒng)發(fā)酵酸乳為樣品，篩選理化性能較好的乳酸菌，對乳酸菌的開發(fā)和保藏有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳酸菌分離樣品

采集自喀什市、疏勒縣、疏附縣的自然發(fā)酵酸奶，于4 ℃保存，帶回實驗室備用。

1.1.2 試劑

細菌基因組提取試劑盒：北京天根生化有限公司；2×Power Taq PCR MasterMix、DL2000 Marker：北京百泰克生物技術(shù)有限公司；PCR引物、瓊脂糖：上海捷瑞生物公司。

1.1.3 試驗儀器

雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；生物顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；電子天平 上海眾淵實業(yè)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海青海儀器有限公司；PCR儀、5430R高速冷凍離心機、移液器 德國Eppendorf公司；電泳儀 北京六一儀器廠；JY04S-3C凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基[5]：蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，牛肉膏1%，K2HPO40.2%，檸檬酸二胺0.2%，醋酸鈉0.5%，葡萄糖2%，吐溫-80 0.1%，MgSO4·7H2O 0.06%，MnSO4·4H2O 0.025%。

MRS固體培養(yǎng)基：向肉湯培養(yǎng)基中加入1.5%～2%的瓊脂。

用醋酸調(diào)節(jié)pH至6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

MC培養(yǎng)基[6]：大豆蛋白胨0.5%，牛肉浸粉0.3%，酵母浸粉0.3%，葡萄糖2%，乳糖2%，碳酸鈣1%，瓊脂1.5%～2%，中性紅0.005%，pH值6.0，121 ℃滅菌15 min。

脫脂乳培養(yǎng)基：將牛乳煮沸30 min，過夜冷卻，除去上層乳脂即制得脫脂乳。將脫脂乳置于三角瓶或試管中，108 ℃蒸汽滅菌15 min，即得脫脂乳培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離方法

樣品→梯度稀釋→分離→純化→革蘭氏染色→斜面保藏→耐鹽測定→耐酸測定→DNA提取→16S rRNA序列擴增→遺傳關(guān)系分析。

1.2.2 樣品分離、純化和保藏

稱取10 g酸奶樣品，置于含有90 mL無菌水的250 mL燒瓶中，晃動均勻，獲得10-1酸奶稀釋液，10倍梯度稀釋后，得到10-2～10-8稀釋液，將稀釋液各取1 mL，用溫度降至45 ℃的MRS固體培養(yǎng)基澆注，42 ℃培養(yǎng)24 h。

挑選MRS固體培養(yǎng)基上長勢良好的菌株接種于MC培養(yǎng)基上，挑選含有透明圈的單菌落反復(fù)劃線，42 ℃培養(yǎng)，將純化到的菌株接種于MRS固體斜面培養(yǎng)基上，待長出菌苔后于4 ℃保藏。

1.2.3 初步鑒定

形態(tài)觀察：對純化后獲得的菌株，觀察其基本形態(tài)特征，并進行革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體的大小、顏色、形狀和排列方式[7]。

1.2.4 理化因素對菌株生長的影響

凝乳時間的測定：按3%的接種量，將培養(yǎng)好的MRS液體培養(yǎng)物接入10 mL已滅菌的脫脂乳培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為42 ℃，觀察并記錄凝乳時間；耐鹽能力的測定：將篩選出的凝乳時間較短的菌株按10%的接種量分別接種于含鹽量1%、3%、5%、7%、9%的MRS肉湯培養(yǎng)基中，以不含鹽的10%接種量的MRS培養(yǎng)液為對照，在42 ℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)24 h后測定乳酸菌的存活率[8]；耐酸能力的測定：將篩選出的凝乳時間較短的菌株按10%的接種量分別接種于pH 2，3，4，5的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在42 ℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)2 h后測定乳酸菌的存活率[9,10]。

1.2.5 乳酸菌的16S rRNA基因序列與遺傳分析

使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取乳酸菌的基因組，利用細菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492f(5′-GGTTACCTTGTTACGGACTT-3′)對16S rRNA基因進行擴增。PCR反應(yīng)體系為DNA模板2 μL，引物各2 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 25 μL，補充ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物將送至蘇州金智維有限公司進行測序。將測序結(jié)果利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast工具進行序列同源性搜索，選取數(shù)據(jù)庫中相似度高的16S rRNA序列，通過MEGA 7.0軟件分析乳酸菌的遺傳關(guān)系并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

將采集的3個酸奶樣品，根據(jù)上述乳酸菌的分離方法獲得乳酸菌菌落[12]。挑取長勢優(yōu)良、透明圈明顯的單菌落進行平板劃線分離，獲得9株菌株，分別為F1、F2、F3、K1、K2、K3、L1、L2、L3，觀察菌落特征，大多為圓形，乳白色或白色，表面較光滑。并對菌株進行革蘭氏染色，染色結(jié)果見圖1。9株菌株均為陽性，菌體形態(tài)大體可分為桿狀和球狀，具體表型特征見表1。

圖1 9株菌株的革蘭氏染色(×100)Fig.1 Microscopic observation of 9 strains after Gram staining(×100)

表1 菌株的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of strains

2.2 理化因素對菌株生長的影響

2.2.1 凝乳時間的測定

將培養(yǎng)好的MRS液體培養(yǎng)物以3%的接種量接入10 mL已滅菌的脫脂乳培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)，觀察并記錄凝乳時間，結(jié)果見圖2，挑選出凝乳時間較短的6株菌株K3、L1、L2、L3、F1、F2。

圖2 凝乳試驗Fig.2 Curd test

結(jié)合菌株形態(tài)觀察、革蘭氏染色和凝乳試驗，初步確定6株菌株為乳酸菌，并進行耐鹽和耐酸能力測定。

2.2.2 耐鹽能力的測定

圖3 不同鹽濃度下活菌存活率Fig.3 Survival rates of live bacteria at different salt concentration

將6株菌株按10%的接種量分別接種于含鹽量1%、3%、5%、7%、9%的MRS肉湯培養(yǎng)基中，以不含鹽的10%接種量的MRS培養(yǎng)液為對照，在42 ℃培養(yǎng)24 h后測定乳酸菌的存活率，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，L1在5%鹽濃度時存活率達到45.95%，其余5株菌株的耐鹽性一般，L2的耐鹽性最差，F(xiàn)1在鹽濃度9%時停止生長。

2.2.3 耐酸能力的測定

將6株菌株按10%的接種量分別接種于pH 2，3，4，5的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在42 ℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)2 h后測乳酸菌的存活率，結(jié)果見圖4。F1在pH 2時存活率為6.33%。

圖4 不同pH值下活菌存活率Fig.4 Survival rates of live bacteria at different pH values

由圖3和圖4可知，菌株的耐鹽度和耐酸度各有不同，但是隨著鹽濃度升高和酸度不斷下降，乳酸菌的活菌數(shù)也隨之降低，菌株的生長受到抑制。

2.3 乳酸菌的16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 乳酸菌的16S rRNA基因序列擴增[13]

以6株乳酸菌的基因組為模板，進行16S rRNA片段擴增，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，約在1500 bp左右，結(jié)果見圖5，PCR產(chǎn)物送至蘇州金智維有限公司進行測序。

圖5 PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.5 Electrophoresis results of PCR amplified products

2.3.2 乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序結(jié)果利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast工具進行序列同源性搜索，選取數(shù)據(jù)庫中相似度高的16S rRNA序列，見表2。

表2 菌株同源性分析Table 2 Homology analysis of strains

由表2可知，K3、L1、L2與德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)序列相似性達到100%，L3、F1、F2與發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)序列相似性達到100%，通過MEGA 7.0軟件分析乳酸菌的遺傳關(guān)系并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果見圖6。確定K3、L1、L2為德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)，L3、F1、F2為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)。

圖6 基于16S rRNA序列乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rRNA gene sequence

3 結(jié)論

本試驗以喀什市、疏勒縣和疏附縣采集的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶為樣品，分離乳酸菌，結(jié)合菌落形態(tài)和細胞形態(tài)特征以及菌株的凝乳試驗，篩選出6株菌株(K3、L1、L2、L3、F1、F2)，均為革蘭氏陽性菌，通過耐鹽和耐酸試驗，得知菌株L1在5%鹽濃度、培養(yǎng)24 h時存活率達到45.95%，其余5株菌株的耐鹽性一般，F(xiàn)1在鹽濃度9%時停止生長，但F1在pH 2、培養(yǎng)2 h時存活率為6.33%；提取6株菌的基因組并進行16S rRNA序列擴增、測序，序列比對后，初步確定K3、L1、L2為德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)，L3、F1、F2為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)。