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        紅糖HPLC-DAD指紋圖譜與化學(xué)模式識(shí)別

        2020-03-02 03:37:42陳其釗陳紅香陳嘉敏王桂華李家威余構(gòu)彬
        中國調(diào)味品 2020年2期
        關(guān)鍵詞:分析

        陳其釗,陳紅香*,陳嘉敏,王桂華,李家威,余構(gòu)彬

        (1.廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所),廣東省甘蔗改良與生物煉制 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510316;2.國家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,廣州 510316)

        紅糖是以甘蔗為原料經(jīng)壓榨、“連環(huán)鍋”熬煮、石灰澄清、過濾除雜、蒸發(fā)濃縮、攪拌起晶后形成的非分蜜糖。因沒有經(jīng)過高度精練,紅糖營(yíng)養(yǎng)成分比白砂糖高很多,由于其除糖外還含有維生素和微量元素,如鐵、鋅、錳、鉻等[1,2]。《本草綱目》中記載:沙糖性溫,和脾緩肝。中醫(yī)認(rèn)為,紅糖性溫、味甘、入脾,具有益氣補(bǔ)血、健脾暖胃、緩中止痛、活血化瘀的作用,尤其適合年老體弱、大病初愈、月經(jīng)不調(diào)的人群以及產(chǎn)婦食用[3,4]。日本美容醫(yī)生認(rèn)為,含有紅糖成分的面膜的美容效果比流行的激光祛斑、果酸換膚等更好[5],因其蘊(yùn)含的胡蘿卜素、核黃素、煙酸、氨基酸、葡萄糖等成分對(duì)細(xì)胞有強(qiáng)效抗氧化及修護(hù)的作用,能預(yù)防黑色素生成,持續(xù)美白等。紅糖中的一些酚類物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)還可以清除自由基,維護(hù)細(xì)胞的正常功能和新陳代謝[6]。此外,其中還含有某些可以有效調(diào)節(jié)體內(nèi)各種色素代謝過程的天然酸類和色素調(diào)節(jié)物質(zhì)。

        現(xiàn)代指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于鑒定、溯源、質(zhì)量控制工作,主要原理是將研究對(duì)象的指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似性評(píng)價(jià),即比較兩者間的差異性和共性,從而實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制等目的[7]。通過指紋圖譜的特征性,能更有效甄別樣品;通過對(duì)指紋圖譜的共有峰進(jìn)行對(duì)比監(jiān)控,能有效控制樣品的質(zhì)量,確保樣品質(zhì)量的相對(duì)穩(wěn)定。指紋圖譜應(yīng)用于中藥鑒定領(lǐng)域的技術(shù)體系已比較成熟,現(xiàn)也逐漸應(yīng)用于食品鑒別領(lǐng)域中,目前應(yīng)用比較多的是茶葉、食用菌、調(diào)味料以及肉類這幾類食品的品質(zhì)鑒定上[8-16],準(zhǔn)確度、可靠度、可行性都比較高。

        本試驗(yàn)采用高效液相色譜法,建立了21批紅糖樣品的指紋圖譜,并結(jié)合聚類分析和主成分分析為紅糖產(chǎn)品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二銨、磷酸:分析純;甲醇、乙腈:色譜純,默克公司;pH計(jì):梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:德國IKA公司;e2695高效液相色譜儀:美國沃特世公司。

        21批次紅糖樣品均來自2017-2019年廣東、廣西、云南3個(gè)不同產(chǎn)地的企業(yè)的送檢(見表1)。

        表1 紅糖樣品來源Table 1 The source of brown sugar samples

        續(xù) 表

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 色譜條件

        色譜柱:MYCOTOXTM反相C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:A 0.1 mol/L磷酸二氫鈉(pH 2.3)∶B乙腈為98∶2,等度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;柱溫:30 ℃;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。

        1.2.2 供試品溶液的制備

        稱取10 g樣品,以無水乙醇100 mL作為提取溶液,攪拌,至完全溶解(約30 min),用濾紙過濾,去掉不溶物,將濾液置于雞心瓶中于40 ℃旋干,得到固體。將得到的干燥固體以超純水做溶劑,配制成10 mg/mL的待測(cè)溶液,以0.22 μm微孔濾膜過濾,得到供試液溶液。

        1.3 HPLC指紋圖譜的方法學(xué)考察

        1.3.1 精密度試驗(yàn)

        取同一批次紅糖樣品溶液(編號(hào):S1),連續(xù)進(jìn)樣6次,選取9號(hào)色譜峰為參照峰。計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值。

        1.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

        取同一批次紅糖樣品溶液(編號(hào):S1)共6份,按1.2.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定,記錄保留時(shí)間和峰面積。

        1.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取同一批次紅糖樣品溶液(編號(hào):S1),分別在0,2,4,6,8,12,24 h,按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 紅糖指紋圖譜的測(cè)定

        指紋圖譜方法學(xué)考察表明無論精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)還是穩(wěn)定性試驗(yàn),各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%,表明精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好,符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

        分別取不同廠家的21批紅糖樣品,按1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定,記錄各批次供試品溶液的全波長(zhǎng)指紋圖譜并對(duì)21批次紅糖樣品的紫外色譜指紋圖譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行比較,對(duì)樣品中峰面積較穩(wěn)定且各樣品中共有的色譜峰進(jìn)行標(biāo)定。

        2.2 指紋圖譜共有模式的建立

        將得到的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2012年版),對(duì)選定的HPLC圖譜進(jìn)行多點(diǎn)校正,自動(dòng)匹配,建立不同產(chǎn)地紅糖HPLC指紋圖譜,并計(jì)算相似度值,結(jié)果見圖1、圖2和表1。其中出峰時(shí)間基本一致、峰面積相對(duì)較大的13個(gè)色譜峰被設(shè)為特征共有峰,9號(hào)峰的分離度較好并且峰形對(duì)稱,所以選擇其為參照峰。21批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積范圍見表2。

        圖1 21批紅糖樣品HPLC-PDA色譜指紋圖譜Fig.1 HPLC-PDA fingerprint spectra of 21 batches of brown sugar samples

        圖2 紅糖的HPLC-PDA對(duì)照指紋圖譜Fig.2 HPLC-PDA control fingerprint spectra of brown sugar

        表2 21批樣品共有峰的相對(duì)峰面積Table 2 Relative peak area of common peaks of 21 batches of samples

        2.3 指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)

        由表1可知,不同產(chǎn)地紅糖的指紋圖譜相似度在0.480~0.985之間,說明不同產(chǎn)地的紅糖所含的化學(xué)成分和質(zhì)量有一定的區(qū)別。紅糖的質(zhì)量分級(jí)是以總糖分作為指標(biāo),從相似度看,不同等級(jí)紅糖間的圖譜整體面貌基本一致,個(gè)別樣品比較突出,說明產(chǎn)品質(zhì)量受產(chǎn)地、氣候、生態(tài)環(huán)境及廠家生產(chǎn)工藝的影響。

        2.4 聚類分析

        將21批不同產(chǎn)地的紅糖樣品13個(gè)共有峰相對(duì)峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類,采用組間聯(lián)接法,以歐氏距離(Euclidean Distance)作為樣品分類依據(jù)對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,得到聚類樹狀圖,見圖3。

        圖3 聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

        由圖3可知,當(dāng)類間距離大于20時(shí),21批紅糖樣品聚為A,B兩大類,其中A類分為A1類和A2類,S8、S9、S10、S12、S13、S14、S18聚為A1類,S1、S4、S5、S6、S7、S11、S15、S16、S17、S19、S21聚為A2類,S2、S3、S20聚為B類。

        2.5 主成分分析

        本試驗(yàn)將21批樣品的13個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0軟件,計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣、特征值和方差貢獻(xiàn)率,進(jìn)行主成分分析,并將特征值大于1的成分提取出來,得到數(shù)個(gè)主成分,結(jié)果見表3和表4。

        表3 特征值與貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues and contribution rates

        表4 旋轉(zhuǎn)后公共因子載荷矩陣Table 4 Public factor loading matrix after rotation

        由表3可知,前3個(gè)主成分特征值大于1,對(duì)方差的累積貢獻(xiàn)率為85.593%,因此可見紅糖的多個(gè)成分可以簡(jiǎn)化為3個(gè)主成分進(jìn)行分析。載荷的絕對(duì)值越大,對(duì)主成分的貢獻(xiàn)越大。由表4可知,峰4和峰10在主成分1上有較高的載荷,峰1和峰2在主成分2上有較高的載荷,峰6在主成分3上有較高的載荷(載荷絕對(duì)值大于0.8)。

        2.6 綜合質(zhì)量評(píng)分

        由表5可知,S21樣品主成分因子綜合得分最高,該批樣品中成分 3,4,5,7,9,10,12,13的含量相對(duì)較高,整體質(zhì)量相對(duì)較好。

        2.7 OPLS-DA

        偏最小二乘法是一種化學(xué)計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)方法,廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)中,其所建立的數(shù)學(xué)模型能對(duì)“多靶點(diǎn)、多成分和整體作用”的研究對(duì)象的化學(xué)成分和生物活性物質(zhì)之間的聯(lián)系進(jìn)行有效分析[18,19]。

        將3個(gè)產(chǎn)地的紅糖指紋圖譜中標(biāo)定的13個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA-P 14.0軟件中進(jìn)行分析,建立的模型的R2為0.74,Q2為0.481,為了進(jìn)一步分析,將3個(gè)產(chǎn)地進(jìn)行兩兩對(duì)比,作OPLS-DA分析得到的得分圖,見圖4~圖6。

        圖4 廣東-廣西紅糖OPLS-DA分析得力圖Fig.4 OPLS-DA score plot of brown sugar in Guangdong-Guangxi Province

        圖5 廣東-云南紅糖OPLS-DA分析得力圖Fig.5 OPLS-DA score plot of brown sugar in Guangdong-Yunnan Province

        圖6 廣西-云南紅糖OPLS-DA分析得力圖Fig.6 OPLS-DA score plot of brown sugar in Guangxi-Yunnan Province

        由圖4~圖6可知,不同產(chǎn)地的成分構(gòu)成模式大致可以區(qū)分開。

        根據(jù)主成分分析結(jié)果,選出了兩個(gè)主成分,依據(jù)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)對(duì)分組貢獻(xiàn)越大的原則,結(jié)合由OPLS-DA分析得到的變量投影重要性指標(biāo)(VIP)值,見表6。

        表6 3個(gè)產(chǎn)地的紅糖OPLS-DA分析的VIP值表Table 6 VIP values of OPLS-DA analysis of brown sugar in three producing areas

        找出3個(gè)產(chǎn)地紅糖差異性組分。由表6可知,與產(chǎn)地廣東相比,產(chǎn)自廣西的紅糖在保留時(shí)間為5.825,6.43,7.51,16.54,29.30 min的成分有差異,產(chǎn)自云南的紅糖的保留時(shí)間為7.512,10.40 min的成分有差異,產(chǎn)地廣西與產(chǎn)地云南相比,差異成分為保留時(shí)間6.43,9.22,16.54 min的成分。這些差異成分是區(qū)分3個(gè)不同產(chǎn)區(qū)紅糖質(zhì)量的主要指標(biāo)性物質(zhì)(但由于缺少標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照,暫時(shí)無法對(duì)相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行確認(rèn))。

        3 討論

        采用二極管陣列檢測(cè)器在190~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在210 nm波長(zhǎng)以下有最大吸收,由于接近末端吸收,所以選擇210 nm波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng),在此波長(zhǎng)下色譜圖基線噪音較低,各峰的保留時(shí)間適中,分離度較好,基線穩(wěn)定,有利于指紋圖譜分析。紅糖中的糖分很高,而且沒有紫外吸收,濃縮時(shí)會(huì)使供試液很粘稠而影響測(cè)定,因此利用蔗糖、葡萄糖、果糖這類物質(zhì)在乙醇中的溶解度低,而非糖組分如有機(jī)酸類、氨基酸類、酚類等物質(zhì)能溶于乙醇的特點(diǎn),選擇無水乙醇作為提取溶劑。此外,通過對(duì)磷酸氫二銨-乙腈、磷酸-乙腈、磷酸二氫鈉-乙腈3個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)(等度洗脫)進(jìn)行考察,結(jié)果只有磷酸二氫鈉-乙腈系統(tǒng)各峰分離度比較好;進(jìn)一步優(yōu)化后發(fā)現(xiàn),以乙腈-0.1 mol/L磷酸二氫鈉水溶液洗脫效果最好,出峰數(shù)最多,基線平穩(wěn),各峰分離度均達(dá)到分離要求。

        本次試驗(yàn)通過多點(diǎn)校正得到了21批紅糖指紋圖譜以及對(duì)照?qǐng)D譜,通過數(shù)據(jù)對(duì)比可知21批紅糖基本相似,含量有差別,該指紋圖譜對(duì)紅糖產(chǎn)品的溯源、質(zhì)量控制及功效成分的研究具有參考價(jià)值。

        將3個(gè)產(chǎn)地的紅糖非糖組分的13個(gè)共有峰的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件進(jìn)行主成分分析,分析3個(gè)產(chǎn)地的共有物質(zhì)的含量模式相似情況,尋找主要差異成分。經(jīng)PLS-DA驗(yàn)證模型有效后,通過OPLS-DA分析得到變量投影重要性指標(biāo)(VIP)值可知,3個(gè)產(chǎn)地之間的差異組分主要是保留時(shí)間為5.82,6.43,7.51,16.54,29.30,9.22,10.40 min對(duì)應(yīng)的物質(zhì)。這些差異組分均未知,需要結(jié)合質(zhì)譜等手段進(jìn)一步確定。

        由指紋圖譜對(duì)比分析和主成分分析結(jié)果可知,不同產(chǎn)地紅糖組分的構(gòu)成和含量均存在差異,這種差異可能是由不同產(chǎn)地甘蔗的生長(zhǎng)環(huán)境氣候、土壤以及生產(chǎn)工藝造成的。因此,可以通過建立指紋圖譜的方法,對(duì)未知樣品進(jìn)行指紋圖譜比對(duì),從而實(shí)現(xiàn)溯源的目的。

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