楊文平，馮芳，郝教敏，夏清，靳明凱，楊珍平*，高志強

(1.華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210；2.天津科技大學(xué)， 天津 300222；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

麥綠素(Barley Green)是從麥類植物嫩苗中獲得的一種富含蛋白質(zhì)、維生素、黃酮、超氧化物歧化酶(SOD)等200多種營養(yǎng)物質(zhì)和抗氧化活性組分的最適合人體細胞需要的復(fù)合物質(zhì)[1]，在世界單項資源中目前是養(yǎng)分含量最豐富和均衡的，具有降血糖、降血脂、抗癌、消炎、延緩衰老和抗疲勞等作用[2，3]。在日本，被認(rèn)定為保健食品；在美國，被批準(zhǔn)為食品增補劑。由此，國內(nèi)外對麥綠素的研發(fā)進程明顯加快，國外研制開發(fā)出麥綠素可樂、麥苗膳食纖維食品、青麥酶營養(yǎng)品和麥苗SOD飲料等產(chǎn)品；國內(nèi)麥葉食品開發(fā)較晚，市場上也出現(xiàn)了一些麥葉相關(guān)產(chǎn)品，如麥綠素粉、麥苗粉等，還有麥綠素韌性餅干的研制等。我國幅員遼闊，麥類種質(zhì)資源豐富；麥綠素加工過程工藝參數(shù)因原料的不同而有變化，現(xiàn)階段的開發(fā)研究主要集中在大麥、青稞、蕎麥上[4-6]，而對于小麥的相關(guān)研究報道甚少。彩粒小麥作為珍貴的小麥種質(zhì)資源，因其具有獨特的營養(yǎng)成分和保健功能，備受人們關(guān)注[7]。麥綠素中，蛋白質(zhì)所含氨基酸豐富且易被人體吸收，特別是富含精氨酸、酪氨酸和組氨酸等人體必需的氨基酸，是一種很好的氮源；黃酮和SOD含量高，具有很強的自由基清除能力和抗氧化性能，也是目前最引人關(guān)注和研究最多的生物活性物質(zhì)[8-12]。因此，本研究選擇麥綠素中類黃酮、蛋白質(zhì)含量和SOD酶活性3種有效成分作為評價指標(biāo)，采用水提法對不同品種彩粒小麥苗，包括山農(nóng)紫小麥、紫小麥204W17、黑小麥031244和黑小麥202W20的麥綠素提取工藝進行正交優(yōu)化和比較，為拓寬麥綠素加工原料和深入研究加工工藝提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

4個品種彩粒小麥(TriticumaestivumLinn.)，包括山農(nóng)紫小麥、黑小麥031244、紫小麥204W17、黑小麥202W20。山農(nóng)紫小麥和黑小麥031244由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥研究所提供，紫小麥204W17和黑小麥202W20由山西省農(nóng)科院棉花科學(xué)研究所提供。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

1.2.1 儀器設(shè)備

78-1型磁力攪拌器 常州潤華電器有限公司；WFJ 2100型可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；LD5-2B型低速離心機 北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司；電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；BCD-252KSF型冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.2.2 試劑

3%～4% H2O2溶液，5%亞硝酸鈉溶液，10%硝酸鋁溶液，4% NaOH溶液，無水乙醇，pH 7.8磷酸緩沖液(磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制)，1.3×10-2mol/L Met(甲硫氨酸)溶液，7.5×10-4mol/L NBT(氯化硝基四氮唑藍)，2×10-5mol/L VB2，10-4mol/L EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)溶液，牛血清蛋白，考馬斯亮藍G-250。上述試劑均為分析純配制。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

取洗凈、晾干的培養(yǎng)皿，在其內(nèi)鋪兩層濾紙并潤濕。隨機取約100粒彩粒小麥種子平鋪在濾紙上，加水至剛沒過種子。于室溫下培養(yǎng)4～5 d，移植花盆中培養(yǎng)。割取生長至15 cm左右的彩粒小麥苗，剔除雜質(zhì)和黃葉后，用3%～4% H2O2溶液浸泡20 min，之后用蒸餾水沖洗干凈，待水分晾干后備用。

1.3.2 麥綠素的提取

采用水浸提法，稱取一定量經(jīng)過預(yù)處理的小麥苗于研缽中→按一定的料液比進行研磨→于小燒杯中在一定溫度下攪拌一定時間→于漏斗中過濾，制得濾液待用。

1.3.3 麥綠素中有效成分測定

本研究通過測定類黃酮、蛋白質(zhì)含量以及SOD酶活性來評價麥綠素的提取工藝。

類黃酮含量的測定采用硝酸鋁比色法[13]。取3 mL濾液于10 mL容量瓶中，依次加入0.5 mL亞硝酸鈉、0.5 mL硝酸鋁和4 mL氫氧化鈉，用乙醇定容，測定吸光度。類黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=19.208x-0.0049，y為吸光度，x為待測液濃度。

蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍染色法[14]。移取2 mL濾液，加蒸餾水至10 mL，取混合液1 mL與5 mL考馬斯亮藍反應(yīng)，測其吸光度。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.7407x+0.025，y為吸光度，x為待測液濃度。

SOD活性的測定采用NBT光還原法[15]。取3 mL濾液，加5 mL磷酸緩沖液，離心；取上清液0.1 mL，依次加1.5 mL磷酸緩沖液，0.3 mL Met，0.3 mL NBT，0.3 mL VB2，0.3 mL EDTA，0.2 mL蒸餾水，光照后測吸光度。

計算公式：SOD總活力(U/100 g)=(Ack-Ae)×V/(Ack×0.5×W×Vt)。

式中：Ack為對照管的吸光度；Ae為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積(mL)；Vt為測定時樣品用量(mL)；W為樣品鮮重(g)。

1.3.4 彩粒小麥苗麥綠素提取工藝的正交試驗設(shè)計

采用L9(34)正交試驗設(shè)計。選取對提取麥綠素影響最大的3個單因素：浸提溫度、浸提時間和料液比，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.4 數(shù)理統(tǒng)計與分析方法

對所得數(shù)據(jù)用Excel數(shù)理統(tǒng)計分析軟件整理制表，并進行LSD極差分析與LSR多重比較。用Sigma Plot 10.0軟件對試驗結(jié)果進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種彩粒小麥苗麥綠素中類黃酮含量比較

表2 類黃酮含量的正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test results for the content of flavonoids mg/100 g

續(xù) 表

注：同列大寫字母不同，表示三水平差異極顯著(P<0.01)；同列小寫字母不同，表示三水平差異顯著(P<0.05)，表4和表6同。

由表2正交試驗結(jié)果可知，在實測9組中，山農(nóng)紫小麥、黑小麥031244和黑小麥202W20的提取麥綠素中類黃酮的最佳工藝組合都是A1B3C3，類黃酮含量均在27 mg/100 g以上；紫小麥204W17的最佳工藝組合是A2B2C3，類黃酮含量達到40 mg/100 g以上。由LSR最小極差分析可知，浸提溫度(A)、浸提時間(B)和浸提料液比(C)3個因素對4個品種麥綠素中類黃酮含量的影響次序不同，其中對山農(nóng)紫小麥和黑小麥031244的影響次序是A>C>B，對紫小麥204W17和黑小麥202W20的影響次序是C>A>B。SSR方差分析(見表3)表明，浸提溫度對4個品種麥綠素中類黃酮含量的影響均達到顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平，浸提料液比對3個品種(山農(nóng)紫小麥除外)麥綠素中類黃酮含量的影響均達到顯著(P<0.05)水平，浸提時間對4個品種麥綠素中類黃酮含量的影響均不顯著(P>0.05)?；邴溇G素中類黃酮含量，4種彩粒小麥苗提取麥綠素優(yōu)選后的最優(yōu)工藝組合依次是：A1B3C3、A2B2C3、A1B3C3、A1B2C3。進一步驗證優(yōu)選組合與實測組合，結(jié)果表明：山農(nóng)紫小麥、黑小麥031244、黑小麥202W20提取麥綠素的最優(yōu)工藝皆為A1B3C3，類黃酮含量分別為27.81，27.92，27.18 mg/100 g；紫小麥204W17的最佳工藝是A2B2C3，類黃酮含量為40.21 mg/100 g。

比較上述兩種最優(yōu)工藝組合，后者的溫度較高，說明在一定的范圍內(nèi)，較高溫度有利于破壞植物細胞壁，縮短浸提時間，有利于類黃酮向水溶劑充分地擴散，從而提高類黃酮得率。這4種彩粒小麥苗中紫小麥204W17的類黃酮含量最高，由于類黃酮為次生代謝產(chǎn)物，是在體內(nèi)經(jīng)代謝途徑生成的，由此可推斷紫小麥204W17代謝途徑更為旺盛，若想制得富含類黃酮的麥綠素保健產(chǎn)品應(yīng)選取該品種。

注：“*”為P<0.05；“**”為P<0.01，表5和表7同。

2.2 不同品種彩粒小麥苗麥綠素中蛋白質(zhì)含量比較

表4 蛋白質(zhì)含量的正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of the content of protein %

續(xù) 表

由表4正交試驗結(jié)果可知，在實測9組中，山農(nóng)紫小麥、黑小麥031244和黑小麥202W20的提取麥綠素中蛋白質(zhì)的最佳工藝組合都是A1B3C3，蛋白質(zhì)含量分別為47.70%、33.54%和38.19%；紫小麥204W17的最佳工藝組合是A2B2C3，蛋白質(zhì)含量達到49.07%。由LSR最小極差分析可知，浸提溫度(A)、浸提時間(B)和浸提料液比(C)3個因素對4個品種彩粒小麥苗麥綠素中蛋白質(zhì)含量的影響次序不同，其中對山農(nóng)紫小麥和黑小麥031244的影響次序是A>C>B，對紫小麥204W17和黑小麥202W20的影響次序是C>A>B。SSR方差分析(見表5)表明，浸提溫度對4個品種彩粒小麥苗麥綠素中蛋白質(zhì)含量的影響均達到顯著(P<0.05)水平，浸提料液比對紫小麥204W17和黑小麥202W20 2個品種麥綠素中蛋白質(zhì)含量的影響達到顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平，浸提時間對4個品種麥綠素中蛋白質(zhì)含量的影響均未達到顯著水平(P>0.05)。基于麥綠素中蛋白質(zhì)含量，4個品種彩粒小麥苗提取麥綠素優(yōu)選后的最優(yōu)工藝組合依次是：A1B3C3、A2B2C3、A2B3C3、A1B3C3。經(jīng)驗證，山農(nóng)紫小麥和黑小麥202W20提取麥綠素中蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝均為A1B3C3，蛋白質(zhì)含量分別是47.72%和38.18%；黑小麥031244提取麥綠素中蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝是A2B3C3，蛋白質(zhì)含量是33.95%；紫小麥204W17提取麥綠素中蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝是A2B2C3，蛋白質(zhì)含量是49.04%。

以蛋白質(zhì)為指標(biāo)，4個品種彩粒小麥苗的麥綠素最佳提取工藝都不盡相同。可能是因為蛋白質(zhì)不像類黃酮物質(zhì)一樣僅存在于胞基質(zhì)中，它還分布在細胞膜上，而4個品種彩粒小麥苗細胞結(jié)構(gòu)有所不同，所以蛋白質(zhì)的提取量更易受到溫度、提取時間以及料液比的影響。其次，在測定蛋白質(zhì)含量時，也受到環(huán)境溫度的影響。溫度的高低決定著染液蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成速度，并隨著試劑溫度的升高，復(fù)合物吸光值也會增加。再者，由于考馬斯亮藍染液有兩種不同顏色形式的光譜重疊，隨著更多的染液和蛋白質(zhì)結(jié)合，試劑的背景值不斷地減少，這些因素都會引起蛋白質(zhì)含量的差異以及工藝的不同。

表5 蛋白質(zhì)含量的方差分析Table 5 Analysis of variance of the content of protein

2.3 不同品種彩粒小麥苗麥綠素中SOD酶活性比較

表6 SOD酶活性的正交試驗結(jié)果Table 6 Orthogonal test results of SOD activity U/100 g

續(xù) 表

由表6正交試驗結(jié)果可知，在實測9組中，4個品種彩粒小麥苗提取麥綠素中SOD酶活性的最佳工藝組合都是A3B3C2，SOD酶活性范圍在1103～1867 U/100 g之間。由LSR最小極差分析可知，浸提溫度(A)、浸提時間(B)和浸提料液比(C)3個因素對4個品種彩粒小麥苗麥綠素中SOD酶活性的影響次序相同，均是A>B>C。經(jīng)SSR方差分析(見表7)表明，浸提溫度對4個品種彩粒小麥苗麥綠素中SOD活性的影響均達到顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平，浸提時間對山農(nóng)紫小麥和紫小麥204W17 2個品種麥綠素中SOD活性的影響達到顯著(P<0.05)水平，浸提料液比對4個品種小麥苗麥綠素中SOD活性的影響均不顯著(P>0.05)?；邴溇G素中SOD酶活性，4個品種彩粒小麥苗提取麥綠素優(yōu)選后的最優(yōu)工藝組合依次是：A3B3C2、A3B1C2、A3B3C3、A3B2C1。經(jīng)驗證，4個品種彩粒小麥苗提取麥綠素中SOD酶活性的最優(yōu)工藝均為A3B3C2，SOD酶活性依次是1865.3，1106.4，1250.7，1640.1 U/100 g。本研究中山農(nóng)紫小麥苗麥綠素中SOD含量最高，若要制備SOD可考慮選擇從該小麥苗中提取。

表7 SOD酶活性的方差分析Table 7 Analysis of variance of SOD activity

2.4 不同品種彩粒小麥苗的麥綠素含量評價

基于類黃酮、蛋白質(zhì)含量和SOD酶活性，為了便于比較4個品種彩粒小麥苗的麥綠素含量，將優(yōu)選后的不同品種彩粒小麥苗麥綠素提取工藝匯總，見表8。并依據(jù)公式評價指數(shù)=C蛋白質(zhì)+C類黃酮+CSOD/100，計算出4個品種彩粒小麥苗的麥綠素含量評價指數(shù)，見表8。結(jié)果表明，兩種紫小麥的麥綠素含量更高。

表8 4個品種彩粒小麥苗的麥綠素含量評價Table 8 Evaluation of barley green content of four varieties of color-grained wheat seedlings

3 結(jié)論

基于麥綠素中類黃酮、蛋白質(zhì)含量和SOD酶活性，采用水浸提法和正交試驗對不同品種彩粒小麥苗麥綠素提取工藝進行優(yōu)化并做含量比較，結(jié)果表明，紫小麥204W17苗麥綠素中類黃酮和蛋白質(zhì)含量均最高，分別為40.21 mg/100 g和49.04%，其提取的最佳工藝條件為浸提溫度25 ℃，浸提時間2.0 h，浸提料液比1∶4；山農(nóng)紫小麥苗麥綠素中SOD含量最高，為1865.3 U/100 g，其提取的最佳工藝條件為浸提溫度30 ℃，浸提時間2.5 h，浸提料液比1∶3。綜合評價得出紫小麥204W17苗和山農(nóng)紫小麥苗的麥綠素含量更高。