張安琪，王玉瑩，李 瑞，周國(guó)衛(wèi)，王 琳，王喜波*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

牛乳因含有許多人體生命活動(dòng)所必需的營(yíng)養(yǎng)成分而被廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域中[1-2]。熱處理雖然使乳中蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，但能抑制乳中微生物的生長(zhǎng)。其中酪蛋白為全價(jià)蛋白質(zhì)，約占牛乳總蛋白的80%[3]，所以熱處理后酪蛋白結(jié)構(gòu)的變化對(duì)牛乳的熱穩(wěn)定性極為重要。目前常用的巴氏殺菌方法有兩種：低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌（如65 ℃、30 min）和高溫短時(shí)巴氏殺菌（如72 ℃、15 s）[4]。國(guó)內(nèi)外對(duì)經(jīng)巴氏殺菌處理的牛乳的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)研究較多，如孫佳悅等[5]曾用紅外光譜法探究巴氏殺菌處理對(duì)乳蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響；王喜波等[6]研究了巴氏殺菌處理對(duì)牛乳中乳清蛋白的影響；Donato等[7]研究了熱處理后牛乳中乳清蛋白與酪蛋白結(jié)合物的性質(zhì)；Considine等[8]研究了熱處理后乳蛋白結(jié)構(gòu)的變化。

超巴氏殺菌（120～125 ℃處理數(shù)秒）是近年來出現(xiàn)的一種熱處理方法[9]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)超巴氏殺菌處理牛乳的風(fēng)味和感官評(píng)價(jià)進(jìn)行了研究[10-11]，而對(duì)超巴氏殺菌處理后酪蛋白的結(jié)構(gòu)變化鮮有研究。所以，本實(shí)驗(yàn)以牛乳為原料，通過納米粒度分析儀、掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡分別對(duì)3 種巴氏殺菌處理酪蛋白的微觀結(jié)構(gòu)和凝聚性質(zhì)進(jìn)行研究，探究超巴氏殺菌對(duì)酪蛋白結(jié)構(gòu)的影響，為生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高并且保質(zhì)期長(zhǎng)的乳制品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳 哈爾濱本地奶站；IPG緩沖液pH3-10美國(guó)通用公司；乙醇 天津市博迪化工有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastersizer 2000激光粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器公司；S-3400掃描電子顯微鏡、JEM-1200EX透射電子顯微鏡日本日立公司；PE Pyris 6差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國(guó)PerkinElmer公司；ALPHA-1-4-LSC冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂乳的制備及熱處理

將新鮮牛乳在4 ℃條件下4 000 r/min離心30 min，取出后棄去上層脂肪即得到脫脂乳。對(duì)照組為未經(jīng)過熱處理的脫脂乳，將脫脂乳進(jìn)行3 種巴氏殺菌處理，即65 ℃ 30 min、72 ℃ 15 s、121 ℃ 5 s（超巴氏殺菌），前兩種熱處理方法使用水浴鍋處理，當(dāng)牛乳的中心溫度達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需溫度后開始計(jì)時(shí)，超巴氏殺菌方法使用高壓鍋加熱，加熱結(jié)束后將脫脂乳迅速于冷水中冷卻至室溫。將殺菌結(jié)束后的脫脂乳于4 ℃避光保存。

1.3.2 酪蛋白的提取

采用等電點(diǎn)沉淀法[12]提取酪蛋白，用1 mol/L HCl溶液將脫脂乳的pH值調(diào)至4.6，然后在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，下層沉淀即為酪蛋白，取7 g酪蛋白于燒杯中，加入去離子水?dāng)嚢柚镣耆芙?，將pH值調(diào)至8.0后定容到200 mL，于-20 ℃保存。

1.3.3 粒徑的測(cè)定

粒徑采用Mastersizer 2000型激光粒度儀進(jìn)行測(cè)定[13]。取40 mL酪蛋白溶液，加入到500 mL去離子水中，待攪拌裝置攪拌均勻后開始測(cè)定。泵的速率為1 800 r/min，顆粒折射率為1.460，分散劑折射率為1.330，顆粒吸收率為0.1。

1.3.4 透射電子顯微鏡測(cè)定酪蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)

采用JEM-1200EX型透射電子顯微鏡測(cè)定熱處理后酪蛋白溶液的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)。用去離子水將酪蛋白樣品稀釋10 倍，劇烈振蕩15 min，取200 μL稀釋后的酪蛋白溶液于透射電子顯微鏡專用銅網(wǎng)上，保持15 min，然后采用體積分?jǐn)?shù)3%的鈾染液漂浮負(fù)染色90 s，最后在無菌恒溫條件下干燥20 min，然后在80 kV電壓下進(jìn)行觀察[14]。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察酪蛋白表面結(jié)構(gòu)

參照Phadungath[15]和Dalgleish[16]等的方法，采用掃描電子顯微鏡測(cè)定酪蛋白表面結(jié)構(gòu)，并依據(jù)樣品處理的需要進(jìn)行調(diào)整，將不同熱處理的酪蛋白溶液用凍干機(jī)凍成粉末，在掃描之前必須經(jīng)過固定、脫水、導(dǎo)電3 個(gè)過程的前處理。固定液通常為含有戊二醛的磷酸鹽緩沖液，選用乙醇梯度脫水法進(jìn)行脫水處理，用離子噴射器在酪蛋白粉表面噴厚度15 nm的金箔，加速電壓為5 kV。

1.3.6 DSC曲線的測(cè)定

將酪蛋白溶液置于鋁盒中，密封后在樣品箱中存放，于室溫下平衡8 h，空鋁盒為空白對(duì)照，從20 ℃加熱到110 ℃，升溫速率為10 ℃/min，得到DSC曲線[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對(duì)酪蛋白粒徑分布的影響

圖 1 不同熱處理?xiàng)l件下酪蛋白粒徑分布Fig. 1 Particle size distribution of casein under different heat treatment conditions

如圖1所示，對(duì)照組、65 ℃ 30 min和72 ℃ 15 s處理后酪蛋白膠束的粒徑分布區(qū)間主要為1～100 μm，兩種常用巴氏殺菌處理后，其粒徑無明顯變化，因?yàn)槔业鞍自?0 ℃以下較穩(wěn)定。121 ℃ 5 s處理后酪蛋白膠束的粒徑區(qū)間向右移動(dòng)，粒徑明顯增加，可能是因?yàn)樽陨戆l(fā)生離解和凝聚，使得粒徑增大[18]，也可能是在超巴氏殺菌處理時(shí)乳清蛋白變性黏附在酪蛋白表面使粒徑增加[19]。

圖 2 不同熱處理?xiàng)l件下酪蛋白平均粒徑Fig. 2 Average particle sizes of casein under different heat treatment conditions

由于酪蛋白膠束的粒徑分布區(qū)間廣泛，而熱處理后變化區(qū)間范圍也較大，所以借助平均粒徑來說明不同熱處理方式對(duì)酪蛋白膠束粒子大小變化的影響。不同熱處理?xiàng)l件下酪蛋白的平均粒徑如圖2所示，對(duì)照組酪蛋白平均粒徑為7.27 μm，與對(duì)照組相比，65 ℃ 30 min處理的樣品平均粒徑（6.19 μm）略有減小，但差異不顯著（P＞0.05），這是因?yàn)槔业鞍啄z束表面的κ-酪蛋白單體發(fā)生解離[20]；72 ℃ 15 s處理的樣品平均粒徑（8.91 μm）略有增加（P＞0.05），是因?yàn)殡S著溫度的升高，酪蛋白自身凝聚程度大于解離程度，所以粒徑逐漸增加[20]；而121 ℃ 5 s處理的樣品平均粒徑（88.98 μm）顯著增加（P＜0.05），是由于溫度過高時(shí)，除了酪蛋白的自身凝聚，其疏水相互作用也會(huì)增強(qiáng)，酪蛋白由膠束態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂瘧B(tài)[20]。Anema等[21]研究也表明，當(dāng)熱處理溫度不大于70 ℃時(shí)，酪蛋白膠束的平均粒徑小于未經(jīng)過熱處理的樣品；當(dāng)熱處理溫度大于70 ℃時(shí)，酪蛋白膠束的粒徑隨著熱處理溫度的提高而緩慢增加，但是增加得并不明顯；只有熱處理溫度大于90 ℃時(shí)，酪蛋白膠束的粒徑才會(huì)顯著提高。由圖2可看出，實(shí)驗(yàn)中未經(jīng)過熱處理的酪蛋白平均粒徑為7.27 μm，比文獻(xiàn)[22-23]中粒徑（50～350 nm）小，可能是因?yàn)槭褂玫牧６葍x的型號(hào)不同，還可能是酪蛋白膠束的粒徑與pH值有密切關(guān)系[24]，提取酪蛋白時(shí)選用的pH值條件不同，所以粒徑不同。

2.2 熱處理對(duì)酪蛋白凝聚性質(zhì)的影響

圖 3 不同熱處理?xiàng)l件下酪蛋白的透射電子顯微鏡圖Fig. 3 Transmission electron microscopic images of casein under different heat treatment conditions

本實(shí)驗(yàn)中，酪蛋白溶液的pH值為8.0，常溫透射電子顯微鏡放大10 000 倍，可以觀察到納米級(jí)的結(jié)構(gòu)。未經(jīng)過熱處理的酪蛋白膠束的體積較小（圖3A），是因?yàn)槲唇?jīng)過熱處理的牛乳提取酪蛋白后幾乎不含乳清蛋白[25]。65 ℃ 30 min處理的樣品結(jié)構(gòu)更為松散（圖3B），可能是酪蛋白表面的單體還在離解。72 ℃15 s處理后的樣品，溶液中的酪蛋白相互締結(jié)、疊加在一起，凝聚成圓形或橢圓形的膠束，形成一個(gè)巨大的網(wǎng)絡(luò)（圖3C）。121 ℃ 5 s處理的樣品，圓形微粒展開，與其他展開的膠束融合、疊加在一起，形成更巨大的聚合物，并且內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加緊密厚實(shí)（圖3D），可能是酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)被破壞，也可能是因?yàn)榧訜釡囟鹊纳撸龠M(jìn)乳清蛋白與酪蛋白的絡(luò)合，從而引起粒子體積的增大[26]，導(dǎo)致牛乳在貯藏過程中容易形成沉淀，降低其穩(wěn)定性降低，縮短保質(zhì)期。

2.3 熱處理對(duì)酪蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖 4 不同熱處理?xiàng)l件下酪蛋白的掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron microscopic images of casein under different heat treatment conditions

如圖4所示，與對(duì)照組相比，65 ℃ 30 min處理的樣品表現(xiàn)出更不規(guī)則、更無序的碎片結(jié)構(gòu)，這可能是因?yàn)榈蜏亻L(zhǎng)時(shí)間的熱處理會(huì)使酪蛋白膠束發(fā)生解離，并且隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，解離程度會(huì)越來越大，部分酪蛋白的解離會(huì)使蛋白變得更加細(xì)碎，大小不一[27]。而72 ℃ 15 s處理的樣品則更加均勻規(guī)則，這說明隨著溫度的升高，維持酪蛋白膠束的次級(jí)鍵受到破壞，使酪蛋白表面的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，同時(shí)，酪蛋白膠束與膠束之間也進(jìn)一步黏附，形成更大更均一的狀態(tài)[28]。121 ℃ 5 s處理的樣品，酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)被破壞，形成較多小顆粒的酪蛋白，并出現(xiàn)更大程度的凝聚狀態(tài)，這是因?yàn)殡S著加熱溫度的升高，乳蛋白與κ-酪蛋白之間的結(jié)合增強(qiáng)，從而形成更巨大的蛋白分子[29]。根據(jù)酪蛋白掃描電子顯微鏡圖可知，所有組別中，65 ℃ 30 min處理的酪蛋白平均直徑最小，而121 ℃ 5 s處理的酪蛋白平均直徑最大，結(jié)果與粒徑實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。熱處理后酪蛋白微觀結(jié)構(gòu)的改變意味著牛乳的理化性質(zhì)發(fā)生改變，即會(huì)對(duì)牛乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味及貯藏穩(wěn)定性等產(chǎn)生一系列的影響。

2.4 熱處理對(duì)酪蛋白熱力學(xué)性質(zhì)的影響

圖 5 不同熱處理?xiàng)l件下酪蛋白DSC圖Fig. 5 DSC analysis of casein under different heat treatment conditions

由圖5可知，被測(cè)蛋白質(zhì)的變性溫度越高，說明其蛋白結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定；熱焓（吸熱峰面積）越大，說明樣品蛋白質(zhì)的變性程度越低[30]。4 個(gè)樣品均表現(xiàn)為不同的變性溫度和變性焓，可能是因?yàn)闊崽幚韺?duì)酪蛋白各個(gè)單體及酪蛋白與乳清蛋白結(jié)合物的影響不同，從而導(dǎo)致整個(gè)酪蛋白體系的熱穩(wěn)定性不同。

表 1 DSC圖譜峰的綜合分析Table 1 Comprehensive analysis of peaks in DSC spectra

由表1可以看出，與對(duì)照組相比，3 組巴氏殺菌處理的熱變性溫度均升高。其中，72 ℃ 15 s處理的酪蛋白變性溫度最高，這可能是因?yàn)闊崽幚硎沟鞍踪|(zhì)不斷解離，轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼰o序的狀態(tài)，該狀態(tài)對(duì)熱較為穩(wěn)定，當(dāng)超巴氏殺菌處理時(shí)，由于加熱溫度的升高，酪蛋白膠束與解離的酪蛋白單體之間又凝聚在了一起[31]。熱焓（ΔH）表示蛋白質(zhì)的變性程度，65 ℃ 30 min處理的樣品吸收峰面積比對(duì)照組小，說明熱變性程度更高；該組變性溫度（90.6 ℃）高于對(duì)照組和超巴氏殺菌組，說明穩(wěn)定性更高。72 ℃ 15 s處理的樣品與其他3 組相比熱焓最低，表明72 ℃ 15 s處理的酪蛋白變性程度最大，變性溫度（99 ℃）最高，說明穩(wěn)定性最高，是因?yàn)?0 ℃以上熱處理時(shí)乳清蛋白會(huì)變性，從而與κ-酪蛋白形成復(fù)雜的配合物[32]。以上說明，巴氏殺菌（65 ℃ 30 min、72 ℃ 15 s）處理會(huì)提高酪蛋白的穩(wěn)定性；而121 ℃ 5 s處理的酪蛋白變性程度比巴氏殺菌處理的低，可能是因?yàn)橹半x解的酪蛋白膠束又凝聚交聯(lián)在一起[33]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以新鮮牛乳為原料，探究超巴氏殺菌處理后酪蛋白微觀結(jié)構(gòu)及凝聚性質(zhì)的變化，同時(shí)以未經(jīng)過熱處理及常用的兩種巴氏殺菌處理后的酪蛋白樣品進(jìn)行比較，采用電子顯微鏡和熱力學(xué)等方法對(duì)3 種巴氏殺菌法處理酪蛋白進(jìn)行分析。結(jié)果表明，超巴氏殺菌方法處理的酪蛋白，其膠束結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其發(fā)生大面積的凝聚、交聯(lián)，粒徑明顯增加。巴氏殺菌處理會(huì)增加牛乳酪蛋白的穩(wěn)定性，但超巴氏殺菌處理牛乳會(huì)破壞部分酪蛋白膠束原有的形態(tài)，使其發(fā)生凝聚交聯(lián)。超巴氏殺菌方法處理后的酪蛋白熱穩(wěn)定性高于對(duì)照組，酪蛋白變性程度低于兩種常用的巴氏殺菌方法，且其熱處理時(shí)間短，可以提高生產(chǎn)效率。同時(shí)，熱處理后酪蛋白結(jié)構(gòu)更為無序，其穩(wěn)定性會(huì)提高，從而延長(zhǎng)保質(zhì)期。