肖 瑀，郭 麗，鄧銀鳳，王 懿，朱晨晨，杜先鋒,*

（1.安徽農業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036；2.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353）

紅薯塊莖中含有質量分數(shù)10%～30%的淀粉[1]，但是天然紅薯淀粉在應用和加工上存在很多局限性：比如透明度差會直接影響到紅薯淀粉產(chǎn)品的外觀和可接受性；淀粉糊黏度過高不適合用于要求高濃度、低黏度的食品和化工行業(yè)；此外還有因溶解性差等而難以控制的缺陷[2]。因此，為了改善天然紅薯淀粉的一些應用缺陷，并進一步擴大其應用范圍，通常采用物理、化學或酶法對其進行分子結構修飾以提高加工性能，相較于物理和化學改性，酶法改性具有健康、綠色、環(huán)保且反應產(chǎn)物專一、反應條件溫和等優(yōu)點[3]。紅薯淀粉中含直鏈淀粉（20%～30%，質量分數(shù)，下同）和支鏈淀粉（70%～80%）。許多研究表明支鏈淀粉的分支鏈結構對淀粉的物化特性具有至關重要的作用[4-8]，例如支鏈淀粉的短支鏈比例與溶脹能力、糊化焓和淀粉消化程度成正比，而與糊化溫度和結晶度成反比。Guo Li等[9]發(fā)現(xiàn)，具有更高支化度和更多短鏈的支鏈淀粉不易被淀粉酶水解。為有效地修飾紅薯淀粉的分支鏈結構，本研究首先將α-淀粉酶通過內切淀粉的α-1,4-糖苷鍵水解成較多的線性鏈，然后結合β-淀粉酶，通過從淀粉非還原性末端依次外切α-1,4-糖苷鍵，部分縮短外鏈長度，進一步生成更多的線性短鏈，最后利用葡萄糖苷轉移酶將兩種水解酶酶解后生成的線性短鏈通過α-1,6-糖苷鍵轉糖基作用以生成新的分支點[10]，增加分支密度。本實驗以紅薯淀粉為原料，采用α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖苷轉移酶的復合處理調控紅薯淀粉分支鏈結構，獲得了不同分支密度和短鏈數(shù)的紅薯淀粉，從而使紅薯淀粉具備了不同物化性質，為開發(fā)具有一定親水性、透明度、黏度和凝膠強度的紅薯淀粉基產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅薯淀粉 四川友嘉食品有限公司；α-淀粉酶（酶活力50 U/mg）、β-淀粉酶（酶活力53 U/mg） 美國Sigma公司；葡萄糖苷轉移酶（酶活力25 000 U/mL）日本天野酶制劑有限公司；普魯蘭酶（酶活力400 U/mL）丹麥諾維信公司；異淀粉酶（酶活力240 U/mg） 愛爾蘭Megazyme公司；所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ICS-5000分析型離子色譜系統(tǒng) 美國加州森尼維爾Dionex公司；NMI20-015V-I核磁共振成像分析儀 蘇州紐邁電子科技有限公司；D8 Discover A25 X射線衍射儀德國布魯克AXS公司；Nicolet IS50傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾公司；UV-5500紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；DHR-1旋轉流變儀上海沃特世科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復合酶改性紅薯淀粉的制備

將10 g紅薯淀粉樣品與200 mL（pH 6.9、0.02 mol/L）乙酸鈉緩沖溶液在沸水浴中持續(xù)攪拌30 min。取出冷卻至50 ℃，加入80 mgα-淀粉酶后，于50 ℃條件下水浴振蕩8 h（100 r/min），然后沸水浴15 min終止反應。待樣液溫度冷卻至37 ℃，使用0.02 mol/L乙酸緩沖溶液調節(jié)pH值至5.2，加入10.6 mgβ-淀粉酶后，于37 ℃條件下水浴振蕩6 h（100 r/min），然后沸水浴15 min終止反應。將樣液溫度升溫至55 ℃，使用0.02 mol/L乙酸緩沖溶液調節(jié)pH值至5.0，分別加入不同添加量（50、100、150、200、250、300 μL）的葡萄糖苷轉移酶后置于55 ℃下水浴振蕩10 h，然后沸水浴15 min終止反應。待樣液冷卻至室溫，使用乙醇沉淀處理，3 000 r/min離心10 min，將沉淀冷凍干燥，即獲得復合酶修飾后的改性紅薯淀粉樣品（W1、W2、W3、W4、W5、W6，分別對應不同添加量葡萄糖苷轉移酶的樣品）。通過不添加酶的酶改性淀粉制備流程獲得對照樣品。

1.3.2 直鏈淀粉比例和鏈長分布的測定

采用碘比色法測定直鏈淀粉比例[11]。采用高效陰離子交換色譜（high performance anion-exchange chromatography equipped with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD）法測定淀粉的鏈長分布[12]。將10 mg待測淀粉樣品溶于2 mL體積分數(shù)90%的二甲基亞砜溶液，在沸水浴中持續(xù)攪拌20 min。待樣液冷卻至室溫后，加入6 mL無水乙醇，3 000 r/min離心15 min，取出沉淀，加入2 mL pH 4.0、50 mmol/L乙酸鈉緩沖溶液后，在沸水浴中持續(xù)攪拌20 min。然后使樣液在40 ℃下達到平衡，加入5 μL異淀粉酶后，在40 ℃下緩慢攪拌24 h，最后沸水浴10 min終止反應，取400 μL樣液，用150 mmol/L氫氧化鈉溶液將其稀釋至2 mL，0.45 μm濾膜過濾。將過濾后的樣品注入ICS-5000 HPAEC系統(tǒng)，以1 mL/min的流速洗脫樣品。流動相為150 mmol/L氫氧化鈉溶液（洗脫液A）和含有500 mmol/L醋酸鈉的150 mmol/L氫氧化鈉溶液（洗脫液B）。將洗脫液B與洗脫液A混合，洗脫條件如下：0～15 min，15%～34% B；15～26 min，34%～40% B；26～52 min，40%～49% B；52～58 min，49%～100% B；58～60 min，100%～15% B；60～80 min，15% B。

1.3.3 分支密度的測定

采用質子核磁共振氫譜測定改性前后紅薯淀粉的分支密度[13-14]。稱取5 mg待測淀粉樣品溶解在1 mL重水（D2O）中，沸水浴中持續(xù)攪拌30 min，然后冷卻并冷凍干燥。再將冷凍干燥樣品重新溶解在0.6 mL的D2O中。以潘糖作為標準品，在溫度80 ℃條件下進行質子核磁共振光譜測定。α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵的核磁共振光譜出峰位置分別在δ5.4和δ5.0確定。通過公式（1）計算分支密度。

式中：Sα-1,4和Sα-1,6分別是α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵的核磁共振光譜峰面積。

1.3.4 結晶結構的分析

淀粉的結晶特性使用X射線衍射儀測定。程序條件設定為：電壓40 kV，電流200 mA，衍射角（2θ）的旋轉范圍為3°～40°，掃描速率為1.2°/min，步長0.02°。每個樣品的掃描時間約為30 min[15]。

1.3.5 溶解度的測定

配制質量分數(shù)2%的淀粉乳液，在90 ℃恒溫水浴30 min后，將其快速冷卻至室溫。然后在2 200 r/min、20 min的條件下進行離心。將上清液倒至培養(yǎng)皿中，并在105 ℃下干燥至恒質量。按照公式（2）[16]計算其溶解度。

式中：m1為可溶性淀粉質量/g；m2為樣品總質量/g。

1.3.6 透明度的測定

配制質量分數(shù)1%的淀粉乳液，在沸水浴中不斷加熱攪拌30 min，待淀粉糊冷卻至25 ℃，以蒸餾水作參比，使用紫外-可見分光光度計測定淀粉糊在640 nm波長處的透光率[17]。

1.3.7 流變特性的測定

配制質量分數(shù)6%的淀粉乳液，在95 ℃水浴條件下不斷加熱攪拌30 min，待其冷卻至室溫，即可進行測定，使用DHR-1旋轉流變儀進行流變特性的測定。表觀黏度與剪切速率的關系測定條件設定為：溫度為25 ℃，剪切速率為0～300 s-1。儲能模量和損耗模量與角頻率的關系測定條件設定為：應變?yōu)?%，掃描頻率為0.1～100 rad/s[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗測定均重復3 次。實驗結果用平均值±標準差表示。采用Origin 7.5軟件中Tukey’s檢驗進行單因素方差分析來確定數(shù)據(jù)差異的顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 復合酶修飾對紅薯淀粉直鏈淀粉比例和鏈長分布的影響

表 1 不同酶處理改性淀粉與對照樣品的直鏈淀粉比例、鏈長分布Table 1 Amylose contents and chain length distributions of modified sweet photo starches

表1顯示了所有樣品的直鏈淀粉比例，經(jīng)α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖苷轉移酶依次處理后直鏈淀粉比例較對照組明顯降低，且隨葡萄糖苷轉移酶添加量從50 μL增加至300 μL，直鏈淀粉比例從22.53%下降至12.81%，這個結果可能是因為復合酶的降解和分支作用，形成新的分支點，從而將直鏈淀粉轉化為支鏈淀粉，因此降低了直鏈淀粉的比例。采用HPAEC-PAD測定了復合酶處理紅薯淀粉的鏈長分布，結果如表1所示，根據(jù)鏈長的聚合度（degree of polymerization，DP）將鏈長分布劃分為4 個部分：A鏈、B1鏈、B2鏈和B3鏈[19]。與對照組相比，經(jīng)α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖苷轉移酶修飾后淀粉的A鏈和B1鏈比例增加，而B2鏈和B3鏈的比例降低，并且隨著葡萄糖苷轉移酶添加量的增加，A鏈和B1鏈的比例持續(xù)增加，B2鏈和B3鏈的比例則持續(xù)降低。當葡萄糖苷轉移酶添加量增加至300 μL時，A鏈和B1鏈比例分別增加至40.25%和53.82%，B2鏈和B3鏈比例則分別減少到3.41%和2.52%。同時，經(jīng)復合酶處理后淀粉的平均鏈長相比于對照組明顯縮短，且隨著葡萄糖苷轉移酶添加量從50 μL增加至300 μL，平均鏈長從18.41逐漸下降至9.42。說明復合酶處理后，紅薯淀粉的短鏈比例顯著增加，平均鏈長顯著降低。

2.2 復合酶修飾對紅薯淀粉分支密度的影響

通過液態(tài)核磁共振氫譜法[20]深入研究紅薯淀粉分支密度。淀粉的分支側鏈是由α-1,4-糖苷鍵連接的線性鏈通過α-1,6-糖苷鍵鏈接α-D-吡喃糖基單元形成的。Hernández等[21]報道在δ5.4、δ5.0和δ4.8處的核磁峰分別代表α-1,4-糖苷鍵中端基質子、α-1,6-糖苷鍵中端基質子和水峰，而在δ3.3～4.5范圍內的核磁峰則分別代表H-2、H-3、H-4和H-5。如圖1所示，所有經(jīng)α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖苷轉移酶修飾后的紅薯淀粉α-1,6-糖苷鍵峰面積明顯大于對照樣品，說明淀粉內部經(jīng)葡萄糖苷轉移酶作用存在著明顯的鏈轉移。且所有酶改性淀粉均比對照樣品有著更高的分支密度，并隨葡萄糖苷轉移酶添加量的增加（從50 μL增加至300 μL），分支密度呈增加趨勢（從21%增加至35%），與平均鏈長的變化規(guī)律相似。以上結果說明，先通過α-淀粉酶和β-淀粉酶水解天然紅薯淀粉的α-1,4-糖苷鍵，從而使其外鏈長變短，產(chǎn)物的平均鏈長也隨之減小，再通過葡萄糖苷轉移酶的作用將游離的葡萄糖殘基以α-1,6-糖苷鍵的形式連接到其他鏈上，形成了新的分支側鏈，提高了分支密度。

圖 1 不同酶處理改性淀粉與對照樣品的質子核磁共振氫譜分析圖Fig. 1 1H NMR analysis of native and modified starches

2.3 復合酶修飾對紅薯淀粉結晶結構的影響

圖 2 不同酶處理改性紅薯淀粉與對照樣品的X射線衍射圖Fig. 2 X-ray diffraction patterns of native and modified starches

由圖2可看出，天然紅薯淀粉不僅在15.0°和23.5°附近出現(xiàn)兩個強衍射峰，且在17.2°和18.2°出現(xiàn)兩個連峰，并在19.7°處具有較低強度的峰，這是典型的CA-型晶體結構，與之前的研究結果[22]一致。由于淀粉糊化后，淀粉顆粒吸水膨脹凝膠化，因此對照樣品沒有衍射峰。然而，經(jīng)α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖苷轉移酶處理淀粉的衍射峰發(fā)生了較大變化，如圖2所示，在23.5°處的原始峰消失，在15.3°、17.2°和18.3°處的原始峰強度變弱，這說明天然紅薯淀粉晶型被完全破壞。但酶改性淀粉在13.1°處出現(xiàn)了新的衍射峰，并且在19.7°處的峰值也相對增加，這意味著被破壞的晶體結構可能重新排列成弱C型晶體結構，又由于13.1°和19.7°處的衍射峰是V型結晶結構的典型峰[23]，因此經(jīng)復合酶修飾后的改性淀粉結晶結構為C+V型，而V型為主要晶型。與天然紅薯淀粉相比，酶改性淀粉在19.7°處的較高峰強度可能是因為經(jīng)復合酶修飾后的高分支淀粉具有更多的短直鏈葡聚糖，與無水乙醇的復合物有利于V型晶體結構的形成[24]。天然紅薯淀粉的相對結晶度為38.8%，所有酶改性淀粉的相對結晶度均低于天然紅薯淀粉，但酶改性淀粉的相對結晶度呈現(xiàn)出隨著葡萄糖苷轉移酶添加量的增加而增加的趨勢，從10.8%增加至14.8%，這是因為隨著葡萄糖苷轉移酶添加量增加，短直鏈葡聚糖也越多，其與無水乙醇的復合物有利于形成V型晶體結構，因此相對結晶度會增大。

2.4 復合酶修飾對紅薯淀粉溶解度和透明度的影響

表 2 不同酶處理改性淀粉與對照樣品的溶解度和透明度Table 2 Solubility and transmittance of native and modified sweet photo starches

所有樣品的溶解度如表2所示，與對照樣品相比，酶改性淀粉的溶解度顯著提高，且隨著葡萄糖苷轉移酶添加量從50 μL增加至300 μL，溶解度從48.48%逐漸提高至66.15%。這個結果與先前的研究一致，Jensen[25]和Sievert[26]等指出，淀粉新分支點的引入會抑制直鏈淀粉的重結晶、葡聚糖鏈的重新排列以及高度有序支鏈淀粉簇的形成，使溶解度增加。此外，Takata等[27]的研究表明，具有低直鏈淀粉比例、高短鏈比例的高分支聚合物高度可溶。

如表2所示，透明度的變化規(guī)律與溶解度相似，相比于對照樣品，酶改性淀粉的透明度明顯提高，并隨葡萄糖苷轉移酶添加量從50 μL增加至300 μL，溶解度從61.72%逐漸提高至73.91%，這是因為復合酶修飾后直鏈淀粉比例減少，分支密度增加，當?shù)矸酆?，分子間不易形成聚合作用[28]，從而抑制了淀粉回生后凝膠束的形成，因此提高了淀粉糊液的透明度。

2.5 復合酶修飾對紅薯淀粉流變特性的影響

由圖3可知，對照和酶改性淀粉糊的表觀黏度隨著剪切速率的增加而降低，而酶改性淀粉糊的表觀黏度明顯低于對照淀粉糊，這表明酶改性淀粉糊溶液為典型的剪切變稀流體，且比對照淀粉糊具有更大的剪切稀化能力。同時，酶改性淀粉糊的表觀黏度隨著葡萄糖苷轉移酶添加量的增加略微降低。酶改性淀粉糊表觀黏度的降低可能是因為經(jīng)復合酶修飾后直鏈淀粉比例相對較低，分支密度增加，導致直鏈淀粉間形成的纏結減少，并降低了聚合物凝膠網(wǎng)絡的重建速度[29]，從而降低了黏度。此外，根據(jù)Li Wenwen[30]的研究結果，高分支密度會降低鏈間締合，從而降低凝膠網(wǎng)絡內接合區(qū)的含量，產(chǎn)生更大的剪切稀化能力。因此，隨著葡萄糖苷轉移酶添加量的增加，分支密度越高，剪切稀化能力越大，表觀黏度則越小。

圖 3 不同酶處理改性紅薯淀粉與對照樣品的表觀黏度隨剪切速率變化曲線Fig. 3 Curves of apparent viscosity against shear rate for native and modified starches

圖 4 不同酶處理改性紅薯淀粉與對照樣品的儲能模量和損耗模量隨角頻率變化曲線Fig. 4 Curves of storage modulus and loss modulus against angular frequency for native and modified starches

對照和酶改性淀粉糊的儲能模量（G’）和損耗模量（G”）隨角頻率的變化如圖4所示，G’和G”分別用來表征淀粉糊的彈性特征和黏性特征。對照淀粉糊的G’和G”隨角頻率升高均呈規(guī)律性的逐漸增加，且在整個頻率范圍內G’始終遠遠大于G”，這表明對照淀粉糊表現(xiàn)出較弱的凝膠狀行為[31]。酶改性淀粉糊的G’和G”曲線特征與對照淀粉糊相似，但明顯低于對照樣品，且隨葡萄糖苷轉移酶添加量的增加而逐漸降低，說明凝膠的剛性、強度和黏彈性隨著葡萄糖苷轉移酶添加量的增加而明顯下降。這是因為淀粉經(jīng)復合酶修飾后，直鏈淀粉比例減少，分支點增加，使直鏈淀粉間不能有效地聚集形成三維凝膠網(wǎng)絡結構。

3 結 論

使用α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖苷轉移酶復合修飾紅薯淀粉，與原紅薯淀粉相比其分支密度增加，直鏈淀粉比例減少，平均鏈長降低，相對結晶度、表觀黏度、儲能模量和損耗模量降低，溶解度和透明度均有所提高。紅薯淀粉物化特性還受到葡萄糖苷轉移酶添加量的影響，實驗表明隨著葡萄糖苷轉移酶添加量的增加，表觀黏度和黏彈性逐漸降低，溶解度和透明度則逐漸增大。這可能是因為在α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖苷轉移酶的連續(xù)催化反應下，隨著葡萄糖苷轉移酶添加量的增加，產(chǎn)生了更多的分支點和更均勻的短支鏈淀粉，可能形成了具有相似鏈長且對稱的短鏈分支，以促進淀粉有序結構的形成。