唐曉棟 趙 慶 蘭曉飛 葛黁黁 唐仲海 樊成虎

(甘肅省中醫(yī)院脊柱一科,蘭州 730050)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是臨床上的常見病，多發(fā)于60歲以上的老年人，其中男性、女性發(fā)病率分別為9.6%、18%[1]。KOA以軟骨細(xì)胞丟失，軟骨形態(tài)改變、 破壞，伴關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生性反應(yīng)等病理改變?yōu)橹鳎斐申P(guān)節(jié)軟骨退行性改變、損傷，導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)功能障礙、疼痛等臨床癥狀，嚴(yán)重影響患者的身心健康及生活質(zhì)量[2,3]，因此修復(fù)軟骨形態(tài)及功能，抑制軟骨損傷是治療KOA的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，豨薟草是一種嶺南特色中藥，具有清熱解毒、祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)的功效，可緩解關(guān)節(jié)疼痛，用于治療風(fēng)濕痹癥、腰膝酸軟、筋骨無力等癥狀[4]，能減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥，改善其臨床癥狀[5]，因此豨薟草可能對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷具有治療作用。sirt1/FOXO1介導(dǎo)炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，以白藜蘆醇激活該信號，可減輕腎病患者的氧化應(yīng)激損傷及炎性細(xì)胞浸潤程度[6]；另外，sirt1蛋白、FOXO轉(zhuǎn)錄因子在軟骨細(xì)胞生長、成熟和基質(zhì)合成等生理過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，激活sirt1可抑制軟骨細(xì)胞凋亡，減輕其氧化應(yīng)激損傷，抑制關(guān)節(jié)炎病情發(fā)展[7,8]，因此調(diào)控sirt1/FOXO1信號可能是豨薟草減輕膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷的作用機制，本研究通過建立KOA大鼠模型，探討豨薟草調(diào)控sirt1/FOXO1通路對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雄性SD大鼠購于上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SYXK(滬) 2014-0005，質(zhì)量合格證號：2015000504404，SPF級，體重：180～220 g。在本院動物房中飼養(yǎng)：晝夜交替、自然光照，恒溫25℃，相對濕度為50%，大鼠自由飲水、攝食，期間定時添加飼料及飲用水、更換墊料、對鼠籠進行清理及消毒，保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔、安靜，通風(fēng)良好，每小時換氣8～12次。

1.1.2主要試劑與儀器 豨薟草(JD-21822)購自上海晶都生物技術(shù)有限公司；脫鈣液(RKD0025)購自長沙達爾鋒生物科技有限公司；軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)ELISA試劑盒(ER0462)購自武漢菲恩生物科技有限公司；尼克酰胺(ab120864)、TNF-α ELISA試劑盒(ab100785)、IL-1β ELISA試劑盒(ab100768)、兔源GAPDH一抗(ab181602)，兔源sirt1一抗(ab189494)，兔源FOXO1一抗(ab39670)，羊抗兔二抗(ab150077)購自美國Abcam公司；acely-FOXO1一抗(YP49437)購自上海亞培生物科技有限公司；HE染色試劑盒(C0105)、RIPA裂解液(P0013K)、BCA試劑盒(P0011)購自上海碧云天公司。YLS-3E電子壓痛儀購自安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；37370足底熱輻射測痛儀購自意大利Ugo Basile公司；Eclipse E200實驗室教學(xué)生物顯微鏡購自日本尼康公司；Elx800酶標(biāo)儀、1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；RM2035輪轉(zhuǎn)切片機、EG1160包埋機、HI1220烤片機購自德國Leica公司；游標(biāo)卡尺、關(guān)節(jié)測量醫(yī)用測角尺購自北京若水合科技有限公司。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立及分組給藥 參照文獻[9]方法：采用棉墊對大鼠左后肢股骨上端到小腿關(guān)節(jié)上1 cm處進行包裹，并以石膏予以固定，待石膏硬化后，將大鼠放回鼠籠繼續(xù)飼養(yǎng)，6周后，拆除石膏。共造模48只，分為模型組、豨薟草組、NA組、豨薟草+NA組4組，每組12只；另取12只大鼠不做處理，設(shè)為對照組。

參照文獻進行劑量換算后，分別以生理鹽水配制終濃度為0.2 g/ml豨薟草溶液[10]、10 mg/ml NA溶液[11]，豨薟草+NA混合溶液(豨薟草為0.2 g/ml，NA為10 mg/ml)，用藥組每天以10 ml/kg的劑量灌胃，模型組和對照組以等劑量的生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)21 d。

1.2.2各組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度、被動活動度測量 給藥結(jié)束24 h后，游標(biāo)卡尺測量記錄各組大鼠患側(cè)膝關(guān)節(jié)寬度，每只大鼠測量3次，取平均值；醫(yī)用測角尺測量各組大鼠患側(cè)膝關(guān)節(jié)被動活動度，具體操作如下：大鼠患側(cè)股骨與量角器的固定尺一端保持平行，關(guān)節(jié)活動的軸心與量角器的軸心位置相對，被動伸直和屈曲大鼠膝關(guān)節(jié)，并隨脛骨屈伸移動角尺，當(dāng)大鼠膝關(guān)節(jié)伸直到最大時，記錄此時角尺角度，為最大伸直角度；當(dāng)大鼠膝關(guān)節(jié)屈曲到最大時，記錄此時角尺角度，為最大屈曲角度。關(guān)節(jié)被動活動度=最大屈曲角度-最大伸直角度，每只大鼠測量3次，取其平均值。

1.2.3各組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值檢測 采用YLS-3E電子壓痛儀測定各組大鼠壓痛閾值：將大鼠以圓桶固定，使其安靜、處于較舒適狀態(tài)，壓痛儀的扁型頭向大鼠患側(cè)后足背施壓，當(dāng)大鼠鳴叫或掙扎時記錄顯示的壓力值即為壓痛閾值；每只大鼠測量3次，每次間隔10 min，取其平均值。采用足底熱輻射測試儀測定各組大鼠熱痛閾值：室溫下將大鼠置于透明有機玻璃箱內(nèi)，待其安靜后，將測試儀上的“十”字形標(biāo)記置于大鼠患側(cè)足底中央，并避開足墊，打開儀器并計時，當(dāng)大鼠鳴叫或抬腿回避時，所用的時間即為大鼠熱痛閾值；每只大鼠測量3次，每次間隔10 min，取其平均值，為防止大鼠被燙傷，測定的時間上限為20 s，溫度上限為35℃。

1.2.4標(biāo)本采集及HE染色1.2.1中各組大鼠麻醉后，尾靜脈取血2 ml，靜置15 min，3 000 r/min，4℃，離心15 min，收集上清即為血清，儲存于-80℃冰箱中備用；打開大鼠患側(cè)關(guān)節(jié)腔，以鋒利刀片取出關(guān)節(jié)軟骨部位，剪取約0.5 g儲存于-80℃冰箱中備用，其他組織置于10%甲醛溶液中固定24 h后，以脫鈣液脫鈣、梯度酒精(由低到高)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，使用切片機做病理切片，對其進行脫蠟、高濃度到低濃度酒精依此浸泡，以HE染色試劑盒進行染色，具體按照說明書進行操作，以同樣方法再次脫水、透明后，進行封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)軟骨病理變化，任選5個視野進行拍照，并根據(jù)軟骨組織的病理改變情況，進行Mankin′s評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如表1，Mankin′s評分為各組之和。

1.2.5各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平測定1.2.4中各組大鼠血清置于4℃解凍，采用ELISA試劑盒測定血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平，具體操作參照說明書步驟進行。

1.2.6各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中sirt1、FOXO1、acely-FOXO1蛋白水平的檢測1.2.4中凍存軟骨組織在研缽中研碎，加入蛋白裂解液(添加蛋白酶抑制劑)于冰浴中采用勻漿機勻漿，得勻漿液，3 000 r/min 4℃離心20 min，取上清液，參照BCA試劑盒說明，以其測定上清液中總蛋白濃度，根據(jù)結(jié)果調(diào)整各組蛋白濃度使之相同，煮沸變性后取20 μl蛋白使用電泳儀SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，分別以兔源GAPDH、sirt1、FOXO1、acely-FOXO1一抗4℃孵育過夜，經(jīng)TBST溶液漂洗3次后，以羊抗兔二抗室溫孵育2 h，TBST再漂洗3次，采用增強化學(xué)發(fā)光法顯色，在凝膠成像儀中觀察并拍攝圖像，以Image J分析各組蛋白的相對表達量。

表1 Mankin′s評分標(biāo)準(zhǔn)[12]Tab.1 Mankin′s score standard[12]

2 結(jié)果

2.1各組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度、被動活動度比較 與對照組相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度升高(P<0.05)，被動活動度降低(P<0.05)。與模型組相比，豨薟草組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度降低(P<0.05)，被動活動度升高(P<0.05)；NA組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度升高(P<0.05)，被動活動度降低(P<0.05)。與豨薟草組相比，豨薟草+NA組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度升高(P<0.05)，被動活動度降低(P<0.05)。與NA組相比，豨薟草+NA組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度降低(P<0.05)，被動活動度升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度、被動活動度比較Tab.2 Comparison of knee joint width and passive activity in shaking groups

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05;compared with the Siegesbeckia orientalis group,3)P<0.05;compared with the NA group,4)P<0.05.

2.2各組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值比較 與對照組相比，模型組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值升高(P<0.05)，NA組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值降低(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+NA組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值降低(P<0.05)；與NA組相比，豨薟草+NA組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值比較Tab.3 Comparison of tenderness threshold and thermal pain threshold of rats in shake

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05;compared with the Siegesbeckia orientalis group,3)P<0.05;compared with the NA group,4)P<0.05.

2.3各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理變化比較 對照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑、結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊有序，潮線清晰可現(xiàn)，基質(zhì)染色無消退；與對照組相比，模型組大鼠軟骨變薄，細(xì)胞數(shù)目減少且排序紊亂，潮線不全，基質(zhì)染色顯著消退等病理損傷，Mankin′s評分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠軟骨病理損傷減輕，Mankin′s評分降低(P<0.05)，NA組大鼠軟骨病理損傷加重，Mankin′s評分升高(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+NA組大鼠軟骨病理損傷加重，Mankin′s評分升高(P<0.05)；與NA組相比，豨薟草+NA組大鼠軟骨病理損傷減輕，Mankin′s評分降低(P<0.05)，見圖1、表4。

圖1 HE染色檢測各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理變化(×400)Fig.1 Pathological changes of knee joint cartilage in rats of each group detected by shaking HE staining(×400)Note:A.Control group;B.Model group;C.Siegesbeckia orientalis group;D.NA group;E.Siegesbeckia orientalis+NA group.

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評分分)Tab.4 Mankin′s score of articular cartilage of rats in shake group

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05;compared with the Siegesbeckia orientalis group,3)P<0.05;compared with the NA group,4)P<0.05.

2.4各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平降低(P<0.05)，NA組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平升高(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+NA組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平升高(P<0.05)；與NA組相比，豨薟草+NA組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平降低(P<0.05)，見表5。

表5 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平比較Tab.5 Comparison of levels of IL-1,TNF-α and COMP in serum of rats in shake

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05;compared with the Siegesbeckia orientalis group,3)P<0.05;compared with the NA group,4)P<0.05.

2.5各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中acely-FOXO1、FOXO1、sirt1蛋白表達比較 與對照組相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中sirt1蛋白表達降低(P<0.05)，acely-FOXO1/FOXO1升高(P<0.05)。與模型組相比，豨薟草組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中sirt1蛋白表達升高(P<0.05)，acely-FOXO1/FOXO1降低(P<0.05)；NA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中sirt1蛋白表達降低(P<0.05)，acely-FOXO1/FOXO1升高(P<0.05)。與豨薟草組相比，豨薟草+NA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中sirt1蛋白表達降低(P<0.05)，acely-FOXO1/FOXO1升高(P<0.05)。與NA組比較，豨薟草+NA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中sirt1蛋白表達升高(P<0.05)，acely-FOXO1/FOXO1降低(P<0.05)，見圖2、表6。

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中sirt1、FOXO1、acely-FOXO1蛋白表達免疫印跡檢測結(jié)果Fig.2 Western blot detection results of sirt1, FOXO1, acely-FOXO1 protein expression in knee cartilage tissue of rats in each groupNote:A.Control group;B.Model group;C.Siegesbeckia orientalis group;D.NA group;E.Siegesbeckia orientalis+NA group.

表6 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中sirt1、FOXO1、acely-FOXO1蛋白表達比較Tab.6 Comparison of protein expression of sirt1, FOXO1, acely-FOXO1 in knee cartilage tissue of rats in each

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05;compared with the Siegesbeckia orientalis group,3)P<0.05;compared with the NA group,4)P<0.05.

3 討論

KOA作為一種老年人多發(fā)病，隨著老齡化社會的到來，發(fā)病率逐年增長、病程長、難治愈，嚴(yán)重時可致殘，使患者生活質(zhì)量下降，造成沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，因而預(yù)防及治療KOA是當(dāng)前的研究熱點[13]。目前臨床治療KOA主要以緩解疼痛等癥狀為主，常用藥物為非甾體類抗炎藥，但無法有效阻止病情進展，且副作用較多，因此抑制軟骨細(xì)胞凋亡、促進軟骨缺損修復(fù)從而阻止病情進展是臨床治療KOA的新方向，但目前缺乏改善軟骨損傷的長期有效的治療手段[14]。研究顯示，豨薟草可下調(diào)關(guān)節(jié)滑膜炎性因子的表達，抑制關(guān)節(jié)炎癥損傷，對各種關(guān)節(jié)炎具有治療作用[15,16]，因此豨薟草可能對KOA大鼠軟骨損傷具有改善作用，本文通過建立KOA大鼠模型，對此進行研究，并對其作用機制初步探索。

研究表明，建立KOA模型有改良伸直位固定、雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物、前交叉韌帶橫斷加內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)等多種方法，其中改良伸直位固定法可有效模擬KOA的臨床癥狀，且操作簡便，在各種研究中得到了廣泛的應(yīng)用[17]，因而本文以改良伸直位固定法建立KOA大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度明顯升高，膝關(guān)節(jié)被動活動度、壓痛閾值、熱痛閾值明顯降低，表明大鼠關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，功能受損，出現(xiàn)KOA典型臨床癥狀；IL-1β、TNF-α是機體細(xì)胞產(chǎn)生的致炎癥因子，在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用[18]，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白COMP可作為關(guān)節(jié)炎軟骨退變進程中的生物標(biāo)記物[19]，模型大鼠出現(xiàn)軟骨變薄，細(xì)胞數(shù)目減少且排序紊亂，潮線不全，基質(zhì)染色顯著消退等病理損傷，Mankin′s評分、血清中IL-1β、TNF-α及COMP水平明顯升高，表明大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨損傷、退變，揭示模型建立成功。以豨薟草灌胃治療后，大鼠膝關(guān)節(jié)寬度、Mankin′s評分、血清中IL-1β、TNF-α及COMP水平降低，膝關(guān)節(jié)被動活動度、壓痛閾值、熱痛閾值升高，表明豨薟草可下調(diào)大鼠致炎因子表達，抑制炎癥反應(yīng)及軟骨損傷，修復(fù)關(guān)節(jié)功能，減輕疼痛，改善KOA大鼠臨床癥狀。

sirt1/FOXO1通路介導(dǎo)關(guān)節(jié)炎發(fā)生及病情進展，sirt1激動劑白藜蘆醇可通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路抑制軟骨細(xì)胞凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)降解，減輕軟骨損傷[8,20]，因此上調(diào)sirt1/FOXO1通路可能是豨薟草治療KOA大鼠軟骨損傷的作用機制。本文研究結(jié)果顯示，模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中sirt1蛋白表達降低，acely-FOXO1升高；以sirt1抑制劑尼克酰胺處理模型大鼠，可使其膝關(guān)節(jié)軟骨組織中acely-FOXO1進一步升高，增強KOA大鼠軟骨損傷，加重關(guān)節(jié)腫脹、疼痛及功能受損等臨床癥狀，以尼克酰胺和豨薟草聯(lián)合處理KOA模型大鼠，尼克酰胺可減弱豨薟草激活sirt1/FOXO1通路及對KOA大鼠的治療作用，表明sirt1/FOXO1通路是治療KOA的一個作用靶點，豨薟草通過上調(diào)sirt1/FOXO1通路減輕膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷，改善其臨床癥狀。

總之，豨薟草可上調(diào)sirt1表達，下調(diào)FOXO1乙?；剑种拼笫笾卵滓蜃颖磉_，減輕軟骨炎癥損傷，修復(fù)關(guān)節(jié)功能，減輕關(guān)節(jié)腫脹、疼痛等臨床癥狀，表明調(diào)控sirt1/FOXO1信號是其發(fā)揮軟骨保護作用的藥理機制之一，要完全探討清楚豨薟草治療KOA的作用機制，還需進一步的深入研究。