吳夏楠 羅 艷 鄒 鱗 賴曉霏

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，重慶 400016)

IL-34是集落刺激因子1受體(colony stimulating factor 1 receptor，CSF-1R)的新配體，在心臟、肝臟、大腦、腎臟及胸腺多個組織均有表達(dá)[1]。盡管IL-34與集落刺激因子1(colony stimulating factor 1，CSF-1)具有相同的受體及相似的功能，但在原始序列中幾乎沒有同源性[2]。有報道認(rèn)為，IL-34與CSF-1R結(jié)合的親和力高于CSF-1，可誘導(dǎo)CSF-1R及其下游分子發(fā)生更強(qiáng)的酪氨酸磷酸化[3]；而與其他兩個受體PTP-ζ及syndecan-1親和力較低[4,5]。

越來越多臨床研究表明，IL-34與多種炎癥性疾病相關(guān)。例如，過敏性紫癜患者急性期血清中IL-34顯著上調(diào)[6]；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜液、成纖維滑膜細(xì)胞和血清中IL-34表達(dá)升高，進(jìn)一步的研究確認(rèn)，IL-34可作為預(yù)測TNF-α拮抗劑治療效應(yīng)的潛在標(biāo)志物[7]。IL-34在炎癥黏膜上皮層和結(jié)締組織浸潤的免疫細(xì)胞中表達(dá)顯著增加[8]。IL-34也可作為慢性乙型肝炎病毒感染患者肝纖維化的一種炎癥生物標(biāo)志物[9]。

IL-34作為一種新的促炎性細(xì)胞因子，影響著免疫和炎癥反應(yīng)的多個方面。IL-34的產(chǎn)生還與神經(jīng)元保護(hù)、感染、自身免疫疾病和血管生成有關(guān)[10]。IL-34在肺癌和肺部感染中表達(dá)上調(diào)，提示IL-34在肺免疫中發(fā)揮重要作用。然而，IL-34是否通過分泌炎癥介質(zhì)直接作用于肺組織細(xì)胞來啟動、放大和維持炎癥反應(yīng)機(jī)制尚不清楚。本研究的主要目的是確定IL-34對人肺成纖維細(xì)胞的影響，并揭示其調(diào)節(jié)肺免疫應(yīng)答的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 原代人肺成纖維細(xì)胞(human lung fibroblasts，HLF)購自美國ScienCell Research，細(xì)胞專用培養(yǎng)基購自美國Gibco Invitrogen。原代人成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS) 購自Cell Applications (San Diego，CA)，用含10%滑膜細(xì)胞生長因子(Cell Applications)的培養(yǎng)基于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2試劑 重組IL-34蛋白購自美國R&D公司，重組IL-4、IL-17A、TNF-α購自美國Peprotech公司；小分子抑制劑 JAK(AG490)、IкB-α(BAY11-7082)、PI3K(LY294002)、ERK(U0126)、MAPK(SB203580)、JNK(SP600125)購自美國Calbiochem，JAK、NF-κB、IкB-α、PI3K、ERK、MAPK、JNK總蛋白抗體及磷酸化蛋白抗體均購自美國Cell Signaling Technology(CST)；抗CSF-1R抗體(AFS98)購自美國GeneTex。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測細(xì)胞IL-34、IL-6及IL-8 mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞總RNA提取使用RNeasy columns試劑盒(Qiagen)進(jìn)行，所有RNA樣品在進(jìn)一步處理前均采用DNase I (Invitrogen)處理。RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA應(yīng)用TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Biosystems)進(jìn)行，GAPDH作為內(nèi)參對照，檢測數(shù)據(jù)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線和比較Ct值法(2-ΔΔCT法)進(jìn)行相對定量分析。

1.2.2ELISA、蛋白印跡法 (Western blot) 檢測蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-6及IL-8表達(dá)采用美國Millipore公司ELISA試劑盒檢測，所有操作按試劑說明書進(jìn)行。細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中(5×106個/培養(yǎng)皿，用IL-34(50 ng/ml)處理細(xì)胞0、10、30、60 min 后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度；等量蛋白質(zhì)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，一抗(1∶1 000)4℃ 孵育過夜；適當(dāng)稀釋的二抗室溫孵育2 h，滴加ECL顯色液，凝膠成像儀觀察結(jié)果。以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白灰度值/β-actin灰度值為目的蛋白的相對表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Sequence of RT-qPCR primer

2 結(jié)果

2.1人肺成纖維細(xì)胞中IL-34受體CSF-1R的表達(dá) 為研究IL-34是否能直接作用于肺組織細(xì)胞，我們檢測了原代人肺成纖維細(xì)胞中CSF-1R的表達(dá)，成纖維樣滑膜細(xì)胞作為陽性對照。結(jié)果顯示，CSF-1R在這兩種細(xì)胞中均有表達(dá)。當(dāng)我們用抗CSF-1R抗體(10 μg/ml)處理肺成纖維細(xì)胞24 h時(圖1B)，與未處理組細(xì)胞(圖1A)相比，CSF-1R表達(dá)顯著降低(P<0.05)。因此，進(jìn)一步證實肺成纖維細(xì)胞表達(dá)IL-34受體CSF-1R。

圖1 CSF-1R在人成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)和肺成纖維細(xì)胞(HLF)中mRNA的表達(dá)情況Fig.1 Expression of CSF-1R mRNA levels in human fibroblast-like synoviocytes(FLS) and lung fibroblasts (HLF)

2.2IL-34刺激人肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8 mRNA表達(dá) 為了研究IL-34對肺成纖維細(xì)胞的影響，重組IL-34在不同時間點(diǎn)以相應(yīng)劑量作用于細(xì)胞。結(jié)果顯示，IL-8 mRNA水平在6 h時增加了近3倍，IL-6 mRNA在24 h時增加了46倍 (圖2A、B)。此外，IL-6和IL-8蛋白表達(dá)水平呈劑量和時間依賴性增加(圖2C、D)；重組IL-34刺激之前，用抗CSF-1R抗由于肺內(nèi)多種免疫細(xì)胞都可以分泌細(xì)胞因子和趨化因子，本研究評估了IL-34誘導(dǎo)IL-6和IL-8 表達(dá)是否為其他細(xì)胞因子共同刺激的結(jié)果。采用重組TNF-α (50 ng/ml)、IL-4 (100 ng/ml)和IL-17A (100 ng/ml) 蛋白單獨(dú)作用或與IL-34(50 ng/ml)共同作用于肺成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示，IL-34分別與這三種炎性細(xì)胞因子聯(lián)合作用時，IL-8和IL-6蛋白水平表達(dá)顯著升高(圖3A～F)。

圖2 IL-34刺激肺成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)IL-8和IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)Fig.2 mRNA and protein expression of IL-8 and IL-6 in human lung fibroblasts induced by IL-34Note: Compared with Control group，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖3 IL-34單獨(dú)或聯(lián)合TNF-α、IL-4、IL-17A 作用肺成纖維細(xì)胞后IL-8 和IL-6 的蛋白表達(dá)情況Fig.3 Protein expression of IL-8 and IL-6 in human lung fibroblasts treated with IL-34,TNF-α,IL-4,IL-17A either alone,or in combinationNote: Compared between groups，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

體(AFS，10 μg/ml)處理細(xì)胞24 h，IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)顯著減弱(P<0.001，見圖2E、F)。

2.3信號分子抑制劑可逆轉(zhuǎn)IL-34誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8表達(dá)升高 MAPK、NF-κB、PI3K-Akt和JAK是肺成纖維細(xì)胞內(nèi)炎性因子表達(dá)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。為了闡明這些激酶的功能作用，本研究應(yīng)用特異性信號通路抑制劑AG490(5 μmol/L)，BAY11-7082 (1.2 μmol/L)，LY294002 (10 μmol/L)，SB203580 (20 μmol/L)， SP600125(5 μmol/L)，U0126 (10 μmol/L) 預(yù)處理肺成纖維細(xì)胞1 h，緊接著IL-34(50 ng/ml)刺激24 h后檢測上清液細(xì)胞因子表達(dá)變化。結(jié)果顯示，p38MAPK、ERK、Akt、NF-κB抑制劑可以逆轉(zhuǎn)IL-34誘導(dǎo)IL-8表達(dá)升高(圖4A)，IL-6表達(dá)主要被JAK、NF-κB、Akt、p38MAPK抑制劑阻斷(圖4 B)，其中p38MAPK抑制劑對二者阻斷效應(yīng)最明顯。提示p38MAPK通路可能在IL-34誘導(dǎo)IL-6和IL-8的產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用。

圖4 信號通路抑制劑對IL-34誘導(dǎo)IL-8和IL-6蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of signaling pathway inhibitors on IL-34-induced IL-8 and IL-6 expressionNote: Compared with IL-34 groups，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

2.4IL-34誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞信號通路磷酸化 為了進(jìn)一步探索IL-34在人肺成纖維細(xì)胞中活化的具體分子途徑，外源性重組IL-34 (50 ng/ml)刺激細(xì)胞，并檢測0、10、30、60 min蛋白的磷酸化。結(jié)果顯示，IL-34作用細(xì)胞后10 min內(nèi)誘導(dǎo)p38MAPK和JAK通路強(qiáng)磷酸化(P<0.01)；Akt、NF-κB信號也在30～60 min誘導(dǎo)較強(qiáng)磷酸化(P<0.001，圖5)。結(jié)果顯示IL-34可能通過MAPK、PI3K-Akt、JAK、NF-κB信號通路誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8。

圖5 IL-34對肺成纖維細(xì)胞 p38 MAPK，ERK，JNK，JAK，Akt，NF-κB細(xì)胞信號分子的影響Fig.5 Effects of IL-34 on activation of p38 MAPK,ERK,JNK,JAK,Akt and NF-κB signaling pathwaysNote: Compared with Time(0) groups，**.P<0.01；***.P<0.001.

3 討論

IL-34參與許多疾病的免疫調(diào)節(jié)。近年來在自身免疫性疾病、炎癥性腸病、感染及神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙中研究較多[9]，在癌癥中的作用也正在顯現(xiàn)：在急性白血病中，IL-34誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向類似單核細(xì)胞的細(xì)胞類型分化，為白血病的治療提供新的思路[11]；IL-34和CSF-1均由增強(qiáng)巨噬細(xì)胞浸潤的乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生，可用于評估復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[12]。在肝細(xì)胞癌中，IL-34表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤，在腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[13]。

在肺癌腦轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)了CSF-1、CSF-1R和IL-34的差異表達(dá)，提示阻斷IL-34信號通路可能是一種新的治療策略[14,15]。此外，阻斷CSF-1R靶向TAM是治療小鼠肺癌的一種方法[16]。在甲型流感感染中，血清和外周血單核細(xì)胞中IL-34水平較高，提示抑制IL-34介導(dǎo)的炎癥通路可能是一種預(yù)防流感的方法[17]。這些研究共同顯示，IL-34參與肺癌和肺部感染免疫調(diào)節(jié)。然而，IL-34作為一種免疫調(diào)節(jié)分子在肺免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制尚不清楚。

先前的研究已經(jīng)表明，在成纖維樣滑膜細(xì)胞中炎性因子TNF-α和IL-1β誘導(dǎo)IL-34的表達(dá)[18,19]。TNF-α與TLR配體共同刺激固有層單核細(xì)胞，IL-34表達(dá)上調(diào)[20]。此外，TNF-α增強(qiáng)由脂肪細(xì)胞分泌的IL-34表達(dá)[21]。然而，當(dāng)我們采用重組TNF-α、IL-1β或脂多糖作用人肺成纖維細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞24 h，沒有檢測到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-34的表達(dá)。當(dāng)然，還需要更多研究來證實IL-34在肺中的來源。IL-34在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和皮膚中具有穩(wěn)定的選擇性表達(dá)，在自身免疫性疾病、感染性疾病、炎癥和癌癥等病理狀態(tài)下被誘導(dǎo)產(chǎn)生，因此，IL-34在病理條件下可通過循環(huán)在肺部表達(dá)[22]。

之前的研究強(qiáng)調(diào)人肺成纖維細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞在肺部感染和免疫中發(fā)揮重要作用[23,24]。IL-6是一種典型的促炎細(xì)胞因子，在炎癥中起關(guān)鍵作用；IL-8是一種中性粒細(xì)胞趨化劑，參與白細(xì)胞浸潤[25]。在本研究中，我們檢測了CSF-1R及炎性因子IL-6、IL-8在人肺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，IL-34作用細(xì)胞后IL-6和IL-8轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平顯著升高；阻斷CSF-1R引起IL-6和IL-8表達(dá)減弱，提示IL-34/CSF-1R通路可能參與IL-34對肺部炎癥反應(yīng)的免疫調(diào)控。

TNF-α、IL-4和IL-17A在氣道炎癥中扮演著重要角色，如哮喘、慢性阻塞性肺病中Th1細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)上調(diào)[26,27]；Th2細(xì)胞因子IL-4促進(jìn)B細(xì)胞IgE的產(chǎn)生，在哮喘發(fā)生中起關(guān)鍵作用[28]。除此之外，IL-4在COPD小鼠模型中也有上調(diào)[29]。

Th17細(xì)胞因子IL-17A在哮喘患者中升高，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集，與嚴(yán)重氣道炎癥相關(guān)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-34聯(lián)合TNF-α、IL-4和IL-17A共同刺激可顯著增強(qiáng)肺成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8的表達(dá)，這可能促進(jìn)嚴(yán)重肺部炎癥和疾病的發(fā)生發(fā)展。在原代人支氣管上皮細(xì)胞中，TNF-α活化Akt、p38 MAPK、IkB-α通路磷酸化誘導(dǎo)IL-6、ICAM1表達(dá)[31]；TNF-α和IL-4促進(jìn)IL-8的釋放[32]；IL-17激活ERK信號通路誘導(dǎo)IL-6、IL-8表達(dá)[33]。這些數(shù)據(jù)表明，IL-34與IL-4、TNF-α、IL-17A誘導(dǎo)IL-6、IL-8表達(dá)可能激活共同的信號通路。

本研究結(jié)果提示，IL-34通過激活MAPK、PI3K-Akt、JAK、NF-κB信號通路誘導(dǎo)IL-6、IL-8表達(dá)，而且這些通路與受體磷酸化相關(guān)。另外，盡管IL-34與其他受體(PTP-ζ和syndecan-1)親和力較低，但是PTP-ζ可以增強(qiáng)IL-34的生物效應(yīng)[4]，syndecan-1是IL-34 /M-CSFR一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)點(diǎn)[5]。因此，在未來的研究中，我們將深入研究人肺成纖維細(xì)胞PTP-ζ和syndecan-1是否參與IL-34介導(dǎo)IL-6、IL-8表達(dá)?？傊?， IL-34通過激活人肺成纖維細(xì)胞MAPK、PI3K-Akt、JAK、NF-κB信號通路誘導(dǎo)IL-6、IL-8表達(dá)，闡明了IL-34在肺成纖維細(xì)胞中的炎癥作用，提示IL-34/CSF-1R通路可能是未來肺部疾病治療策略的潛在靶點(diǎn)。