吳嘉迪 段強(qiáng)軍 肖 楠 汪天明 邵 菁 吳大強(qiáng) 顏貴明 汪長(zhǎng)中

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230000)

酒精性肝病(alcohol liver disease,ALD)是臨床上常見的肝臟疾病，該病主要是由于長(zhǎng)時(shí)間大量酒精刺激引發(fā)的肝臟炎癥損傷，表現(xiàn)為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及肝硬化，甚至肝功能衰竭。因此，ALD已經(jīng)成為需要迫切解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題，如何防控ALD具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

丹皮酚(Paeonol，Pae)又稱牡丹酚，為中藥毛茛科植物牡丹、芍藥和蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿中提取分離出來(lái)的藥效成分[1]。現(xiàn)代研究表明，丹皮酚具有良好的抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用，且毒副作用小，目前在臨床上應(yīng)用廣泛，主要應(yīng)用于治療血栓、動(dòng)脈粥樣硬化、酒精性脂肪肝病[2,3]。另外，丹皮酚的口服和注射給藥對(duì)炎癥/疼痛相關(guān)的適應(yīng)證有效，例如頭痛、神經(jīng)痛、肌肉疼痛、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；丹皮酚的外用制劑可用于多種皮膚疾病，例如濕疹、皮炎、皮膚瘙癢、蚊蟲叮咬、對(duì)過(guò)敏性鼻炎和感冒也有一定作用[2]。因此，丹皮酚具有防治多種疾病的潛能。

隨著近年來(lái) “肝-腸”軸理念的成熟，腸道菌群失調(diào)在ALD中作用日益顯著[4]，尤其是腸道真菌群。有研究表明，長(zhǎng)期酒精刺激，使得腸道真菌失調(diào)，特別是白色念珠菌過(guò)度定植，增加腸黏膜通透性[5]，β-1,3-葡聚糖作為真菌細(xì)胞壁的主要成分之一，其通過(guò)腸屏障轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，與肝巨噬細(xì)胞表面受體Dectin-1結(jié)合活化經(jīng)典 NLRP3/ASC/caspase-1途徑，通過(guò)Syk激酶使NLRP3自身寡聚，并募集接頭分子ASC，后者募集并催化caspase-1前體(pro-caspase-1)自身剪切活化，活化caspase-1，釋放IL-1β、IL-18，引起肝臟炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[6-11]。有研究發(fā)現(xiàn)β-1,3-葡聚糖作用于支氣管上皮細(xì)胞后，NLRP3炎癥小體活化，且IL-1β分泌增加[12]。本課題組前期在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)驗(yàn)證丹皮酚能有效抗ALD[13,14]，但能否對(duì)于真菌菌群失調(diào)所致β-1,3-葡聚糖介導(dǎo)的ALD發(fā)揮作用尚不清楚，本研究擬在體外建立β-1,3-葡聚糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥模型，模擬ALD炎癥損傷模型，從分子水平層面來(lái)驗(yàn)證丹皮酚通過(guò)阻斷Dectin-1/NLRP3信號(hào)通路來(lái)抗ALD炎癥損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑 RW264.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；丹皮酚購(gòu)自宣城市百草植物工貿(mào)有限公司(純度>99%)；β-1,3-D-葡聚糖、昆布多糖購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自上海HAKATA公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自杭州碧云天公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)ambion公司； 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光染料購(gòu)自日本東洋紡公司；抗小鼠β-actin抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司； 抗小鼠Dectin-1抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；抗小鼠caspase-1抗體、抗小鼠NLRP3抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗均購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；抗小鼠ASC抗體和抗小鼠Syk抗體均購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Advansta公司；PCR引物采用 Primer 5.0 設(shè)計(jì)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；小鼠IL-1β、IL-18 ELISA試劑均購(gòu)自泉州睿信生物科技有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 IX51倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本 Olympus公司，TDZ4-WS低速水平離心機(jī)購(gòu)自上海盧湘儀有限公司，5430R 4℃離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、K3型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，PowerPac HC Power Supply 高電流電泳儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù) 將凍存在-80℃冰箱的RAW264.7巨噬細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含 10%的胎牛血清、100 U/ml青、鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每天定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、融合度到80%以上時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行分組，即空白對(duì)照組、β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組、昆布多糖組、丹皮酚干預(yù)組。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)以及前期模型和藥物篩選結(jié)果[15-17]，我們選用70 μg/ml β-1,3-D-葡聚糖造炎癥模型，250 μg/ml作為昆布多糖劑量，480 μmol/L作為丹皮酚劑量?？瞻讓?duì)照組和β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組用DMEM完全培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)24 h，昆布多糖組用昆布多糖(250 μg/ml)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)24 h，丹皮酚干預(yù)組用丹皮酚(480 μmol/L)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)24 h，之后棄掉相應(yīng)的培養(yǎng)基，除空白對(duì)照組加入新鮮含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h外，其余組加入70 μg/ml β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)24 h，最后對(duì)四組的培養(yǎng)液與細(xì)胞進(jìn)行收集。

1.2.2MTT法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的增殖活性 接種3×105ml-1RAW264.7巨噬細(xì)胞于96孔板，待24 h完全貼壁后，棄上清，加PBS清洗3遍，空白對(duì)照組和β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組加入新鮮DMEM培養(yǎng)基，丹皮酚干預(yù)組加入丹皮酚(480 μmol/L)，昆布多糖組加入昆布多糖(250 μg/ml)，分別培養(yǎng)24 h后，棄掉相應(yīng)的培養(yǎng)基，除空白對(duì)照組加入新鮮含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h外，其余組加入70 μg/ml β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)24 h后，避光加入5 mg/ml MTT工作液20 μl，放入二氧化碳培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)2 h后，棄上清，加入200 μl DMSO對(duì)沉著在孔板底部的棕色甲臜沉淀進(jìn)行溶解，室溫放置搖床低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下吸光度值。

1.2.3倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 接種3×105個(gè)/ml RAW264.7巨噬細(xì)胞于6孔板，待24 h完全貼壁后，棄上清，加PBS清洗3遍，空白對(duì)照組和β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組用DMEM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育24 h，Dectin-1抑制劑昆布多糖組用昆布多糖(250 μg/ml)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育24 h，丹皮酚干預(yù)組用丹皮酚(480 μmol/L)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育24 h，之后棄掉相應(yīng)的培養(yǎng)基，除空白對(duì)照組加入新鮮含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h外，其余組加入70 μg/ml β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)24 h，之后棄上清，用PBS清洗3遍后，加入澄清PBS，用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)巨噬細(xì)胞Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)的檢測(cè) 將處理過(guò)的細(xì)胞用提前預(yù)冷的無(wú)菌PBS清洗3次后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下來(lái)并收集到無(wú)酶EP管中，根據(jù)RNA提取試劑盒的步驟進(jìn)行RNA提取。之后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。所有引物采用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)，委托上海生工生物有限公司合成，各引物序列見表1。RT-qPCR反應(yīng)體系25 μl：SYBR熒光染料12.5 μl，上游引物(100 μmol/L)1 μl，下游引物(100 μmol/L)1 μl，cDNA 0.5 μl，DEPC水10 μl。在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 1 min；擴(kuò)增定量程序40個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù):變性94℃ 15 s,退火50℃ 15 s,延伸 72℃ 45 s；溶解曲線60～95℃，加熱速率0.1℃/s，管家基因?yàn)棣?actin，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。定量分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別測(cè)定目的基因 Dectin-1、NLRP3、caspase-1及內(nèi)參β-actin的Ct值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值，用2-ΔΔCt來(lái)表示基因表達(dá)量變化。

1.2.5Western blot檢測(cè)Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1蛋白表達(dá) 取6孔板細(xì)胞置于冰上，每孔加200 μl含PMSF的RIPA裂解液，用干凈的刮刀將細(xì)胞刮于EP管中，冰上裂解30 min，于4℃下12 000 r/min離心15 min，之后加蛋白上樣緩沖液，沸水煮5 min，冷卻后，電泳80 V，30 min；120 V，55 min，轉(zhuǎn)膜120 V，1 h 30 min，室溫封閉2 h，4℃過(guò)夜孵一抗，二抗室溫孵育2 h，洗膜，曝光成像，通過(guò)Image J 軟件分析得出蛋白IOD值，并根據(jù)目的蛋白IOD/內(nèi)參蛋白IOD，計(jì)算目的蛋白相對(duì)灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和IL-18的含量 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書要求，將細(xì)胞懸液于3 000 r/min離心10 min去除顆粒和聚合物；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔，樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，待測(cè)樣品孔里先加入待測(cè)樣品10 μl再加樣品稀釋液40 μl；隨后每孔加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μl，封板，37℃溫育60 min；棄液體，反復(fù)洗滌5次，拍干；每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光溫育15 min；每孔加入終止液50 μl，15 min內(nèi)450 nm波長(zhǎng)下測(cè)各孔吸光度值。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 基因引物序列及基因引物長(zhǎng)度Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR and length of gene primer

2 結(jié)果

2.1丹皮酚對(duì)β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖活性的影響 如圖1,MTT法細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，β-1,3-D-葡聚糖在70 μg/ml濃度能夠明顯抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞存活率下降50%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組相比， 丹皮酚在480 μmol/L濃度能夠明顯促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖活力，細(xì)胞存活率上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 丹皮酚對(duì)β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖活性的影響(n=6)Fig.1 Effect of Paeonol on β-1,3-D-glucan-induced RAW-264.7 macrophages proliferative activity(n=6)Note:Compared with the control group,***.P<0.001；compared with the β-1,3-D-glucan induced model group,##.P<0.01，###.P<0.001.

圖2 丹皮酚對(duì)β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(n=6,×400)Fig.2 Effect of Paeonol on morphology of RAW264.7 macrophages induced by β-1,3-D-glucan(n=6,×400)Note:A,B,C and D were respectively expressed as control group，β-1,3-D-glucan-induced model group，Paeonol 480 μmol/ml group，Laminarin 250 μg/ml group.

2.2丹皮酚對(duì)β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 如圖2，在400倍倒置顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組細(xì)胞體積偏小，呈現(xiàn)飽滿圓潤(rùn)形態(tài)；β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組細(xì)胞分化嚴(yán)重，細(xì)胞體積增大，形態(tài)多不規(guī)則，有“偽足”伸出，細(xì)胞過(guò)于狹長(zhǎng)，有的甚至呈梭形；丹皮酚干預(yù)組細(xì)胞分化明顯改善，細(xì)胞體積變小，“偽足”現(xiàn)象明顯減少，細(xì)胞大部分恢復(fù)至近圓形狀態(tài)。

2.3丹皮酚對(duì)β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)的影響 如圖3，與空白對(duì)照組相比，β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組相比，丹皮酚干預(yù)組Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4丹皮酚對(duì)β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)的影響 如圖4，與空白對(duì)照組相比，β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組Dectin-1、NRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組相比，丹皮酚干預(yù)組Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖3 丹皮酚對(duì)β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表達(dá)的影響(n=3)Fig.3 Effects of Paeonol on proteins expression of Dectin-1,Syk,NLRP3,ASC,pro-caspase-1 and caspase-1 in RAW264.7 macrophages induced by β-1,3-D-glucan(n=3)Note:A,B,C and D were respectively expressed as control group，β-1,3-D-glucan-induced model group，Paeonol 480 μmol/ml group，Laminarin 250 μg/ml group.Compared with the control group,*.P<0.05，**.P<0.01,***.P<0.001；compared with the β-1,3-D-glucan-induced model group,#.P<0.05,##.P<0.01,###.P<0.001.

圖4 丹皮酚對(duì)β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)的影響(n=3)Fig.4 Effect of Paeonol on mRNA expression of Dectin-1,NLRP3 and caspase-1 in RAW264.7 macrophages induced by β-1,3-D-glucan(n=3)Note:Compared with the control group,*.P<0.05，**.P<0.01；compared with the β-1,3-D-glucan-induced model group,#.P<0.05,##.P<0.01.

2.5丹皮酚對(duì)β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、IL-18的影響 如圖5，與空白對(duì)照組相比，β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-18水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組相比，丹皮酚干預(yù)組細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-18水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖5 丹皮酚對(duì)β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-18的影響(n=3)Fig.5 Effect of Paeonol on secretion of IL-1β and IL-18 in RAW264.7 macrophages induced by β-1,3-D-glucan(n=3)Note:Compared with the control group,**.P<0.01,***.P<0.001；compared with the β-1,3-D-glucan-induced model group,#.P<0.05,##.P<0.01，###.P<0.001.

3 討論

β-1,3-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的主要成分，并在真菌過(guò)度增殖或死亡時(shí)從細(xì)胞壁脫落，通過(guò)與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生[18-20]。巨噬細(xì)胞則是通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)來(lái)識(shí)別β-1,3-葡聚糖，并分泌炎癥因子以促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生[21]。 PRRs分細(xì)胞膜外和細(xì)胞膜內(nèi)，膜外以Dectin家族受體研究較多，膜內(nèi)則以NOD樣受體(NOD-like receptor,NLR)備受關(guān)注[22]。其中C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族7成員A(CLEC7A；也稱為Dectin-1)是C型凝集素受體家族的PRRs，識(shí)別真菌細(xì)胞壁上暴露的β-1,3-葡聚糖[23,24]。NLRP3 也叫NOD樣受體蛋白3，屬于炎性復(fù)合體的傳感蛋白[25]。當(dāng)細(xì)胞受到感染刺激時(shí)，被激活的NLRP3形成NLRP3 炎性小體，在炎性小體的作用下，促進(jìn)下游炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的釋放從而引起炎癥反應(yīng)[26-28]。

新近研究表明，腸道真菌變化與ALD存在密切關(guān)聯(lián)，長(zhǎng)期酒精刺激后，腸道真菌菌群紊亂，真菌過(guò)度生長(zhǎng)，β-葡聚糖作為許多共生真菌細(xì)胞壁的主要成分，通過(guò)腸屏障，經(jīng)門靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，與肝巨噬細(xì)胞上的受體Dectin-1結(jié)合，激活NLRP3炎癥小體，釋放IL-1β和IL-18誘發(fā)小鼠ALD炎癥損傷[5,29]。

在前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)Lieber-DeCarli酒精液體飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠建立ALD模型，發(fā)現(xiàn)酒精喂養(yǎng)導(dǎo)致腸道真菌失調(diào)，真菌豐度增加，血清中β-1,3-D-葡聚糖水平升高，肝臟中Dectin-1/NLRP3信號(hào)通路上相關(guān)蛋白表達(dá)量增多，發(fā)生ALD炎癥反應(yīng)。丹皮酚干預(yù)后，腸道真菌失調(diào)得到改善，血清中β-1,3-D-葡聚糖水平降低，肝臟中Dectin-1/NLRP3信號(hào)通路上相關(guān)蛋白表達(dá)量減少，ALD炎癥反應(yīng)得到緩解。我們推斷丹皮酚抗ALD炎癥損傷可能與抑制β-1,3-D-葡聚糖介導(dǎo)的Dectin-1/NLRP3信號(hào)通路存在相關(guān)性。

為了驗(yàn)證丹皮酚是否通過(guò)阻斷Dectin-1/NLRP3信號(hào)通路來(lái)預(yù)防由β-1,3-D-葡聚糖引起的ALD炎癥損傷，我們應(yīng)用β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立體外ALD炎癥損傷模型，在β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后，觀察丹皮酚在造模前干預(yù)下能否對(duì)β-1,3-D-葡聚糖致炎起到預(yù)防保護(hù)作用，并檢測(cè)Dectin-1/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白是否發(fā)生改變。我們還應(yīng)用了Dectin-1阻斷劑昆布多糖來(lái)驗(yàn)證β-1,3-D-葡聚糖刺激效果。實(shí)驗(yàn)研究表明，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性與倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)下的RAW264.7巨噬細(xì)胞發(fā)生炎癥損傷，細(xì)胞增殖活力減弱，細(xì)胞存活率低下，而丹皮酚干預(yù)后能有效緩解并改善RAW264.7巨噬細(xì)胞的炎癥損傷，提升細(xì)胞增殖活力。為了探究丹皮酚抗炎癥損傷的作用機(jī)制，并依據(jù)前期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，我們從β-1,3-D-葡聚糖結(jié)合受體Dectin-1為切入點(diǎn)，進(jìn)而涉及Dectin-1/NLRP3相關(guān)信號(hào)通路。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)24 h后的RAW264.7巨噬細(xì)胞中存在Dectin-1/NLRP3信號(hào)通路激活，相比于空白對(duì)照組，β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)模型組Dectin-1/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白誘導(dǎo)Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1以及炎癥因子IL-1β、IL-18都明顯升高。而丹皮酚干預(yù)24 h后可顯著降低β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1蛋白表達(dá)水平和Dectin-1、NLRP3、Caspase-1 mRNA 表達(dá)水平，以及細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-18水平。提示丹皮酚能顯著預(yù)防β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)所致的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而緩解和改善細(xì)胞增殖活力減弱與細(xì)胞損傷，推測(cè)可能與阻斷Dectin-1/NLRP3信號(hào)通路的激活有關(guān)，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們可以推定丹皮酚是通過(guò)抑制β-1,3-D-葡聚糖，阻斷Dectin-1與之結(jié)合，進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體激活，從而使巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、IL-18水平降低，緩解ALD炎癥損傷。與Xiao等[30]報(bào)道的腸道細(xì)菌菌群失調(diào)導(dǎo)致LPS與TLR4結(jié)合，并激活核因子NF-κB誘導(dǎo)的ALD炎癥損傷相比，我們的研究是基于腸道真菌菌群及其代謝產(chǎn)物β-1,3-D-葡聚糖在ALD中的顯著作用，因此，改善腸道真菌菌群，抑制β-1,3-D-葡聚糖已經(jīng)成為預(yù)防ALD的重要的治療靶點(diǎn)和潛在手段。

總之,丹皮酚可能通過(guò)抑制β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Dectin-1/NLRP3信號(hào)通路上Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1的表達(dá)從而有效降低終末炎癥因子 IL-1β、IL-18 的釋放,進(jìn)而有效抑制ALD炎癥反應(yīng)。我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了丹皮酚可以預(yù)防ALD炎癥損傷，深入探討了丹皮酚對(duì)腸道真菌代謝產(chǎn)物β-1,3-葡聚糖相關(guān)的Dectin-1/NLRP3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的調(diào)控作用，為將其開發(fā)成新型的抗ALD藥物提供新的研究思路和重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。