林志美 李 建 饒 進(jìn) 鄒忠晴 余曉玲

(成都大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，成都 610081)

非霍奇金淋巴瘤是發(fā)病率增長比較快的惡性腫瘤之一，其最常見的病理類型為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤是一種侵襲性腫瘤，具有明顯異質(zhì)性，通過聯(lián)合化療可使一半以上的患者生存期延長，但部分患者仍因腫瘤進(jìn)展而死亡，因此探討彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病的分子機(jī)制對治療具有重要的指導(dǎo)意義[1,2]。人鋅指轉(zhuǎn)錄因子Krüppel 樣因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)是人鋅指轉(zhuǎn)錄因子KLF家族成員，在多種細(xì)胞的生理功能中發(fā)揮重要作用，研究表明KLF4在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等關(guān)系密切[3]，過表達(dá)KLF4可抑制白血病細(xì)胞的增殖和遷移[4,5]。淋巴瘤患者磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路被異常激活，抑制該信號通路對淋巴瘤具有抑制作用[6]。但KLF4在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)及其對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤增殖和侵襲遷移的影響及機(jī)制尚不清楚，本文對KLF4在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力以及PI3K/Akt信號通路的影響進(jìn)行研究，為臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 選擇我院2017年6月～2018年6月初診彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤石蠟組織標(biāo)本60例和同期淋巴結(jié)反應(yīng)增生患者的淋巴結(jié)石蠟組織標(biāo)本60例為對照。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者年齡(48.31±5.36)歲，男性37例，女性23例；淋巴結(jié)反應(yīng)增生患者年齡(47.84±4.97)歲，男性35例，女性25例。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者均為初治患者，均經(jīng)病理證實(shí)為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤，兩組患者均簽署知情同意書。

1.1.2細(xì)胞株 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系ly1細(xì)胞和人B淋巴母細(xì)胞系HMy2.CIR細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.3主要試劑 蘇木素、二甲苯、中性樹膠、DAB試劑盒、3%過氧化氫、抗原修復(fù)液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，兔抗人KLF4單克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體、兔抗人磷酸化-Akt(phospho-rylation-Akt，p-Akt)多克隆抗體、兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人磷酸化-PI3K多克隆抗體(phospho-rylation-PI3K，p-PI3K)(美國Abcam公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、CCK-8試劑、Transwell小室、Matrigel、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcri-ption-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(美國Hyclone公司)，胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)等。

1.2方法

1.2.1免疫熒光雙標(biāo)雙染色測定彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織和對照組織中KLF4表達(dá)情況 將彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤石蠟組織和對照石蠟組織進(jìn)行切片，烤片30 min，梯度酒精水化，蒸餾水洗滌，PBS浸泡，加入抗原修復(fù)液修復(fù)30 min，PBS沖洗，加入過氧化氫孵育30 min，PBS洗滌，加入山羊血清封閉30 min，加入兩種一抗：KLF4抗體和CD20抗體(1∶50)，過夜孵育，對照組加入PBS代替一抗，PBS洗滌，加入熒光二抗(紅色熒光和綠色熒光)1∶500過夜孵育，PBS洗滌，取出玻片，加入緩沖甘油，覆蓋玻片，熒光顯微鏡400倍視野下觀察。KLF4陽性細(xì)胞細(xì)胞核顯紅色熒光，CD20陽性細(xì)胞細(xì)胞膜顯綠色熒光，計(jì)算400倍視野下5個(gè)視野KLF4和CD20雙陽性細(xì)胞數(shù)量，在每個(gè)400倍視野中KLF4陽性細(xì)胞大于15個(gè)為高表達(dá)，低于15個(gè)位低表達(dá)。

1.2.2Western blot測定彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系ly1細(xì)胞和人B淋巴母細(xì)胞系HMy2.CIR細(xì)胞中KLF4蛋白水平 取生長良好的ly1細(xì)胞和HMy2.CIR細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取ly1細(xì)胞和HMy2.CIR細(xì)胞總蛋白，將ly1細(xì)胞和HMy2.CIR細(xì)胞蛋白加入到SDS-PAGE膠不同泳道中電泳，轉(zhuǎn)膜，加入脫脂奶粉封閉2 h，加入鼠抗人KLF4抗體(1∶100)過夜孵育，以β-actin(1∶1 500)為內(nèi)參照，加入羊抗鼠IgG(1∶1 500)孵育1 h，加入發(fā)光顯色液顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像，KLF4蛋白相對表達(dá)量以KLF4吸光度值/β-actin吸光度值。

1.2.3RT-PCR測定彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系ly1細(xì)胞和人B淋巴母細(xì)胞系HMy2.CIR細(xì)胞中KLF4 mRNA水平 取生長良好的ly1細(xì)胞和HMy2.CIR細(xì)胞，加入Trizol提取細(xì)胞總RNA，將ly1細(xì)胞和HMy2.CIR細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用PCR法測定ly1細(xì)胞和HMy2.CIR細(xì)胞中KLF4 mRNA(KLF4上游引物：5′-GGCTGATGGGCAAGTTTGTG-3′，下游引物：5′-CAAGTGTGGGTGGCTGTTCT-3′)，以β-actin為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，94℃ 15 s、55℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt作為KLF4 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.4ly1細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將生長良好的ly1細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組和過表達(dá)KLF4組，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。將三組生長良好的ly1細(xì)胞接種到96孔板中(每孔103個(gè)細(xì)胞)培養(yǎng)24 h，空白對照組不轉(zhuǎn)染病毒，陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照病毒，過表達(dá)KLF4組轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF4病毒，根據(jù)感染復(fù)數(shù)=150稀釋病毒液，取10 μl病毒液加入相應(yīng)培養(yǎng)孔中，再加入促轉(zhuǎn)染劑Polybrene，混勻后培養(yǎng)48 h。

1.2.5Western blot法測定轉(zhuǎn)染后三組ly1細(xì)胞中KLF4蛋白水平，RT-PCR測定轉(zhuǎn)染后三組ly1細(xì)胞中KLF4 mRNA水平，具體方法同1.2.2和1.2.3。

1.2.6CCK-8測定轉(zhuǎn)染后ly1細(xì)胞增殖情況 將三組轉(zhuǎn)染后ly1細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種到96孔板中(每孔5×106個(gè)細(xì)胞)，每孔加入含胎牛血清的培養(yǎng)液，分別在接種后1 d、3 d和5 d于每孔中加入CCK-8液10 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h(每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)7個(gè)復(fù)孔)，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定波長490 nm處吸光度(A)值。

1.2.7Transwell小室法測定轉(zhuǎn)染后ly1細(xì)胞侵襲和遷移能力 在Transwell小室底部膜下表面均勻涂抹10 μl纖連蛋白(1 g/L)，將小室置入培養(yǎng)箱中孵育4 h，將三組轉(zhuǎn)染后ly1細(xì)胞100 μl加入到小室上室(5×105個(gè)細(xì)胞/ml)，下室加入含F(xiàn)BS培養(yǎng)液，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，取出小室用棉簽擦去上室細(xì)胞，多聚甲醛固定遷移到下室的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色下室細(xì)胞30 min，用PBS洗滌3遍，100倍顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。ly1細(xì)胞侵襲能力測定：將Transwell上室用Matrigel膠包被，培養(yǎng)箱中孵育2 h至基質(zhì)膠凝固，其余實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.8Western blot法測定轉(zhuǎn)染后三組ly1細(xì)胞Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白水平，具體方法同1.2.2。

2 結(jié)果

2.1彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織和淋巴結(jié)反應(yīng)增生組織中KLF4表達(dá)情況 CD20表達(dá)在除漿細(xì)胞(分泌免疫球蛋白的B細(xì)胞)外的發(fā)育分化各階段的B細(xì)胞的表面，是最常用的B細(xì)胞標(biāo)記。KLF4和CD20同時(shí)陽性細(xì)胞代表B細(xì)胞中KLF4陽性表達(dá)細(xì)胞。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織B細(xì)胞中KLF4陽性表達(dá)率(38.33%)低于對照組織B細(xì)胞中(56.67%)(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織和對照組織B細(xì)胞中KLF4表達(dá)情況比較[n=60，n(%)]Tab.1 Comparison of KLF4 expression in diffuse large B-cell lymphoma tissue and control tissues[n=60，n(%)]

圖1 免疫組化染色檢查彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織和對照組織中KLF4表達(dá)(×100)Fig.1 Immunohistochemical staining for KLF4 expression in diffuse large B-cell lymphoma tissue and control tissues(×100)Note:A.Diffuse large B-cell lymphoma tissue;B.Control tissue.

2.2彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系ly1細(xì)胞和人B淋巴母細(xì)胞系HMy2.CIR細(xì)胞中KLF4蛋白和mRNA水平 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系ly1細(xì)胞中KLF4蛋白和mRNA水平低于人B淋巴母細(xì)胞系HMy2.CIR細(xì)胞(P<0.01)。見表2和圖2。

表2 ly1細(xì)胞和HMy2.CIR細(xì)胞中KLF4蛋白和mRNA水平比較Tab.2 Comparison of KLF4 protein and mRNA levels in ly1 cells and HMy2.CIR

Note：Compared with HMy2.CIR cell group,1)P<0.01.

圖2 ly1細(xì)胞和HMy2.CIR細(xì)胞中KLF4蛋白Western blot電泳圖Fig.2 Western blot analysis of KLF4 protein in ly1 cells and HMy2.CIR cellsNote:1.ly1；2.HMy2.CIR.

2.3過表達(dá)KLF4對ly1細(xì)胞中KLF4蛋白和mRNA水平的影響 與空白對照組和陰性對照組比較， 過表達(dá)KLF4組ly1細(xì)胞中KLF4蛋白和mRNA水平升高(P<0.01)；空白對照組和陰性對照組ly1細(xì)胞中KLF4蛋白和mRNA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3和圖3。

表3 三組ly1細(xì)胞中KLF4蛋白和mRNA水平比較Tab.3 Comparison of KLF4 protein and mRNA levels in three groups of ly1

Note：Compared with the blank control group,1)P<0.01；compared with the negative control group,2)P<0.01.

圖3 三組ly1細(xì)胞中KLF4蛋白Western blot電泳圖Fig.3 Western blot analysis of KLF4 protein in three groups of ly1 cellsNote:1.Blank control group；2.Negative control group;3.Overexpressing KLF4 group.

2.4過表達(dá)KLF4對ly1細(xì)胞增殖的影響 第1天，三組ly1細(xì)胞A值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第3天和第5天，與空白對照組和陰性對照組比較，過表達(dá)KLF4組ly1細(xì)胞A值降低(P<0.01)；空白對照組和陰性對照組ly1細(xì)胞A值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 三組ly1細(xì)胞A值比較Tab.4 Comparison of A values of three groups of ly1

Note：Compared with the blank control group,1)P<0.01；compared with the negative control group,2)P<0.01.

2.5過表達(dá)KLF4對ly1細(xì)胞侵襲遷移能力的影響 與空白對照組和陰性對照組比較，過表達(dá)KLF4組ly1細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)降低(P<0.01)；空白對照組和陰性對照組ly1細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5和圖4、5。

表5 三組ly1細(xì)胞侵襲遷移細(xì)胞數(shù)比較Tab.5 Comparison of number of invading and migrating cells of three groups of ly1

Note：Compared with the blank control group,1)P<0.01；compared with the negative control group,2)P<0.01.

圖4 測定三組ly1細(xì)胞侵襲能力(×100)Fig.4 Migration ability of three groups of ly1 cells(×100)Note:A.Blank control group;B.Negative control group;C.Overex-pressing KLF4 group.

圖5 測定三組ly1細(xì)胞遷移能力(×100)Fig.5 Determination of invasive ability of three groups of ly1 cells(×100)Note:A.Blank control group;B.Negative control group；C.Overex-pressing KLF4 group.

2.6過表達(dá)KLF4對ly1細(xì)胞PI3K/Akt信號通路的影響 三組ly1細(xì)胞Akt、PI3K蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白對照組和陰性對照組比較，過表達(dá)KLF4組ly1細(xì)胞p-Akt、p-PI3K蛋白降低(P<0.01)；空白對照組和陰性對照組ly1細(xì)胞p-Akt、p-PI3K蛋白比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6和圖6。

表6 三組ly1細(xì)胞Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白水平比較Tab.6 Comparison of Akt，p-Akt，PI3K，p-PI3K protein levels in three groups of ly1

Note：Compared with the blank control group,1)P<0.01;compared with the negative control group,2)P<0.01.

圖6 三組ly1細(xì)胞Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白Western blot電泳圖Fig.6 Western blot analysis of Akt，p-Akt，PI3K，p-PI3K proteins in three groups of ly1 cellsNote:1.Blank control group;2.Negative control group;3.Overexp-ressing KLF4 group.

3 討論

KLF4在人類組織中廣泛表達(dá)，目前發(fā)現(xiàn)的KLF家族成員有17名，在細(xì)胞增殖、分化、生長以及維持正常組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，KLF4為KLF家族成員中最受關(guān)注的分子之一，KLF4位于9q31染色體上，包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域、核定位序列3個(gè)結(jié)構(gòu)域[7,8]。其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于羧基端，高度保守，在調(diào)節(jié)和DNA結(jié)合的特異性中發(fā)揮重要作用；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄活性中發(fā)揮重要作用，位于氨基端；核定位序列在KLF4在細(xì)胞核內(nèi)的定位中發(fā)揮重要作用[9,10]。KLF4和不同的靶基因結(jié)合在不同的腫瘤(mantle cell lymphoma)組織中發(fā)揮促癌或者抑癌作用，研究發(fā)現(xiàn)KLF4在口腔鱗癌、乳腺導(dǎo)管癌中表達(dá)水平升高，發(fā)揮癌基因的作用，而在胃癌、食管鱗癌、肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)降低，發(fā)揮抑癌作用[11]。在血液系統(tǒng)疾病中，F(xiàn)ilarsky等[12]發(fā)現(xiàn)KLF4在慢性淋巴細(xì)胞白血病中失活；李波等[13]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KLF4可促進(jìn)白血病K562細(xì)胞凋亡，抑制K562細(xì)胞增殖；Jiang等[14]發(fā)現(xiàn)上調(diào)KLF4可誘導(dǎo)霍奇金淋巴瘤細(xì)胞凋亡；Li等[15]研究發(fā)現(xiàn)套細(xì)胞淋巴瘤組織中KLF4水平下降。本文研究發(fā)現(xiàn)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織中KLF4表達(dá)水平下降，過表達(dá)KLF4可抑制彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖和侵襲遷移。本研究結(jié)果表明KLF4在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用，KLF4有望成為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

PI3K/Akt信號通路在人體各組織中普遍存在，在細(xì)胞生長、代謝、分化、增殖、存活中發(fā)揮重要作用，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，PI3K/Akt參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等過程，和腫瘤的耐藥關(guān)系也比較密切[16,17]。Akt為PI3K下游效應(yīng)分子，Akt可通過磷酸化腫瘤抑制因子、激酶等多種細(xì)胞蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。Akt活化可促進(jìn)G1期細(xì)胞進(jìn)展，從而加速細(xì)胞周期；Akt與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移關(guān)系也比較密切，Akt的激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[18,19]。淋巴瘤中PI3K/Akt信號通路異常激活，馬濤等[20]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤中PI3K/Akt信號通路異常激活。本研究觀察過表達(dá)KLF4對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KLF4可降低彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K蛋白水平，表明過表達(dá)KLF4可抑制彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路，KLF4對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖和侵襲遷移的抑制作用可能與其抑制PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

綜上所述，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織中KLF4表達(dá)降低，上調(diào)KLF4水平可能通過PI3K/Akt信號通路抑制彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的增殖和侵襲遷移，KLF4有望成為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤潛在的治療靶點(diǎn)。