金君 孫仁華 呼邦傳

[摘要] 血流感染是指病原微生物進(jìn)入血液循環(huán)并生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素、代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)的感染性疾病，是當(dāng)前全世界臨床醫(yī)生面臨的重大挑戰(zhàn)之一。早期診斷并使用有效的抗感染方案能縮短抗生素使用時(shí)長(zhǎng)、降低患者死亡率。血培養(yǎng)及藥物敏感試驗(yàn)是目前臨床診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但其存在病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果時(shí)間長(zhǎng)、陽(yáng)性率低等缺點(diǎn)，不能滿足血流感染危重患者快速及精準(zhǔn)治療的需求。近年來(lái)隨著分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，涌現(xiàn)出DNA微陣列、質(zhì)譜分析、數(shù)字PCR、二代高通量測(cè)序等分子診斷技術(shù)，較血培養(yǎng)能更快速地識(shí)別病原菌及耐藥基因、提高檢測(cè)的陽(yáng)性率，指導(dǎo)臨床醫(yī)師早期進(jìn)行目標(biāo)抗生素干預(yù)，對(duì)改善血流感染患者臨床預(yù)后具有潛在價(jià)值，并可降低病原菌耐藥性。

[關(guān)鍵詞] 血流感染;血培養(yǎng);分子診斷技術(shù);研究進(jìn)展

[中圖分類號(hào)] R631? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）36-0182-06

[Abstract] Bloodstream infection is an infectious disease in which pathogenic microorganisms enter the blood circulation， and grow and multiply， producing toxins and metabolites leading to systemic inflammation. It is one of the major challenges faced by clinicians all over the world. Early diagnosis and effective anti-infection regimens can shorten the duration of antibiotic use and reduce the mortality of patients. Blood culture and drug sensitivity test are the gold standards for clinical diagnosis of bloodstream infection， but they have disadvantages such as the time-consuming detection results of etiology and the low positive rate， which cannot meet the needs of rapid and precise treatment for critically ill patients with bloodstream infection. In recent years， with the development of molecular detection technology， DNA microarray， mass spectrometry， digital PCR， second-generation high-throughput sequencing and other molecular diagnostic technologies have emerged. Compared with blood culture， these techniques can quickly identify pathogenic bacteria and drug-resistant genes， improve the positive detection rate， guide clinicians to conduct targeted antibiotic intervention in the early stage， and have potential value in improving the clinical prognosis of patients with bloodstream infection， and in the long run， reduce the resistance of pathogenic bacteria. Therefore， this paper reviews the research progress of molecular diagnostic techniques for bloodstream infection.

[Key words] Bloodstream infection; Blood culture; Molecular diagnostic technique; Research progress

近年來(lái)，血流感染（Bloodstream infection，BSI）的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，這與重癥病房侵入性操作多、廣譜抗生素使用不合理、多重耐藥菌的增多及人口老齡化等因素相關(guān)。Lamy等[1]的調(diào)查研究數(shù)據(jù)顯示，全球每年BSI患者高達(dá)3150萬(wàn)人，BSI已成為歐洲和北美國(guó)家人群的七大死因之一。近20年來(lái)，發(fā)達(dá)國(guó)家的BSI患病率達(dá)334/10 000～571/10 000，死亡率高達(dá)27%～36%[2]。美國(guó)流行病調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2010年～2015年美國(guó)因BSI入院患者的比例從3.9%上升至9.4%，并導(dǎo)致每年近8萬(wàn)人死亡;歐洲報(bào)道每年有近120萬(wàn)例BSI發(fā)生，可導(dǎo)致15.7萬(wàn)患者死亡。Zhou等[3]對(duì)2017年北京公共衛(wèi)生信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)的調(diào)查研究顯示，當(dāng)年BSI在北京的發(fā)病率達(dá)461/100 000，死亡率為79/100 000，根據(jù)當(dāng)年全國(guó)人口推算，全國(guó)每年新發(fā)BSI例數(shù)達(dá)486萬(wàn)人，死亡例數(shù)為83萬(wàn)人。相較于普通病房，BSI在ICU中的發(fā)病率及病死率顯著增加。謝劍鋒等[4]對(duì)全國(guó)ICU患者的BSI流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查分析，研究顯示BSI發(fā)病率在ICU中高達(dá)20.6%，形勢(shì)非常嚴(yán)峻。

早期檢測(cè)致病菌、合理使用抗菌藥物，能顯著改善BSI患者的預(yù)后。研究顯示，膿毒癥患者每延遲目標(biāo)抗生素治療1 h，死亡率增加7.6%;而延遲抗生素治療6 h，死亡率增加58%[5]。在入住ICU未接受有效抗生素治療的BSI患者中，其60 d死亡率高達(dá)88%[6]。盡管目前BSI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為血培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，但其仍存在較多的局限性，如檢出陽(yáng)性率低，報(bào)告結(jié)果時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24～72 h。此外，對(duì)多種病原菌混合感染進(jìn)行血培養(yǎng)時(shí)，還額外需要24 h進(jìn)行亞培養(yǎng)。研究顯示，對(duì)BSI患者采用經(jīng)驗(yàn)性抗菌治療策略，可能導(dǎo)致多重耐藥病原體的選擇和傳播，并增加侵襲性真菌感染的發(fā)生率[7]。因血培養(yǎng)很難對(duì)BSI進(jìn)行早期診斷，常會(huì)導(dǎo)致診斷錯(cuò)誤或抗生素治療強(qiáng)度不足，對(duì)一些疑似BSI的患者而言可能致命[8]。因此，需要建立一種快速提供病原菌及耐藥信息的檢測(cè)方法，為目標(biāo)抗生素治療方案提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，從而達(dá)到精準(zhǔn)治療的效果。近年來(lái)，隨著分子檢測(cè)手段的發(fā)展，用于快速診斷BSI病原菌的方法層出不窮，這些分子診斷技術(shù)被用于補(bǔ)充血培養(yǎng)的不足，可分為基于陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本病原菌檢測(cè)和全血中直接檢測(cè)病原菌的檢測(cè)方法。前者包括基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析、熒光原位雜交技術(shù)、多重PCR技術(shù)、DNA微陣列技術(shù)等;后者包括實(shí)時(shí)定量PCR、二代測(cè)序技術(shù)、T2磁共振檢測(cè)技術(shù)、數(shù)字PCR技術(shù)等。

1 基于陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本的檢測(cè)方法

1.1 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）

MALDI-TOF MS運(yùn)用不同細(xì)菌、真菌間存在特異性蛋白質(zhì)譜峰的原理鑒定病原菌，該技術(shù)將待測(cè)樣本轉(zhuǎn)化為運(yùn)動(dòng)的離子，在磁場(chǎng)作用下這些離子因不同的質(zhì)荷比分離，檢測(cè)儀記錄這些電離的強(qiáng)度并形成特異性質(zhì)譜圖，與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配后得到檢測(cè)結(jié)果。該技術(shù)在血液培養(yǎng)陽(yáng)性后進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)包括革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌及真菌在內(nèi)的多種微生物，一般較常規(guī)血培養(yǎng)結(jié)果早18～48 h，同時(shí)還可檢測(cè)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和碳青酶烯類耐藥基因[9]，基于該法的VITEK MS系統(tǒng)還可用于鑒別諾卡菌、分枝桿菌和絲狀真菌。該技術(shù)方法可靠，能快速診斷單種菌陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中的病原菌，準(zhǔn)確率達(dá)71%～96%[10-11]。眾多研究顯示，利用MALDI-TOF MS技術(shù)可快速提供有效的微生物學(xué)信息，對(duì)病原菌進(jìn)行快速診斷，據(jù)此，臨床醫(yī)師能更早地調(diào)整抗生素方案，可使患者的住院時(shí)間縮短2～6 d，死亡率降低4%～9%[12-14]。但該技術(shù)仍存在局限性，針對(duì)多菌感染的研究顯示，該法能檢測(cè)85.7%的病原菌[15]，不能鑒定混合培養(yǎng)基中的所有微生物，這可能與同一選擇性培養(yǎng)基生長(zhǎng)的不同微生物量較少有關(guān)，其對(duì)真菌及鏈球菌檢測(cè)的效果較差，且抗生素應(yīng)用會(huì)影響其鑒定的準(zhǔn)確性。此外，該技術(shù)鑒定微生物依賴已知的數(shù)據(jù)庫(kù)，檢測(cè)的準(zhǔn)確性受其數(shù)據(jù)庫(kù)影響，但隨著數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，更多微生物及細(xì)菌耐藥性將被識(shí)別，該技術(shù)的臨床診療價(jià)值也會(huì)隨之增加。

1.2 熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）

熒光原位雜交是通過(guò)熒光素標(biāo)記的寡核苷酸探針特異性結(jié)合靶病原體基因組中的核糖體DNA（rDNA）區(qū)域，即細(xì)菌的16S rDNA基因或真菌的18S rDNA基因，通過(guò)熒光顯微鏡觀察探針和互補(bǔ)序列之間特異性結(jié)合，獲得細(xì)胞核內(nèi)染色體或基因信息的技術(shù)，不依賴病原物質(zhì)的擴(kuò)增。肽核酸熒光原位雜交（Peptide nucleic fluorescent in situ hybridization，PNA-FISH）是利用肽核酸探針（PNA）與生物特異性rRNA雜交，并通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，直接從陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中檢測(cè)常見(jiàn)的病原菌，其根據(jù)革蘭染色結(jié)果選擇特異性探針，包括葡萄球菌探針（金黃色葡萄球菌、CoNS）、腸球菌探針（糞腸球菌、屎腸球菌）、革蘭陰性細(xì)菌探針（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌）和酵母探針（白色念珠菌、光滑念珠菌、副念珠菌、假絲酵母菌）。該技術(shù)常用Accelerate pheno system，該系統(tǒng)能在7 h內(nèi)全自動(dòng)地從陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中快速識(shí)別病原菌及耐藥信息，診斷準(zhǔn)確率達(dá)88.7%～100.0%[16]。有研究顯示，該技術(shù)聯(lián)合抗生素管理方案時(shí)，能明顯降低BSI患者的住院時(shí)間及住院死亡率，在無(wú)明確的抗生素管理方案時(shí)，則可能掩蓋快速診斷帶來(lái)的優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致上述臨床指標(biāo)沒(méi)有明顯改善[17]。PNA-FISH的缺點(diǎn)是檢測(cè)依賴較高的病原數(shù)，檢測(cè)限達(dá)105 CFU/mL，血液中病原菌數(shù)量較少時(shí)不易檢出?？焖贌晒庠浑s交技術(shù)（QuickFISH assay）是多色質(zhì)核酸雜交技術(shù)，檢測(cè)速度較PNA-FISH更快，操作更簡(jiǎn)便快速，大大提高了檢測(cè)效率，其敏感性高達(dá)97.1%～100.0%，特異性為89.5%～100.0%[18-20]。Koncelik等[18-20]利用QuickFISH在30 min內(nèi)鑒別金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌，平均檢出時(shí)間、BSI患者住院時(shí)間、萬(wàn)古霉素使用時(shí)間均較血培養(yǎng)顯著縮短，并且接受QuickFISH檢測(cè)的患者還可節(jié)省總體住院費(fèi)用，提示其在金黃色葡萄球菌感染鑒定中具有價(jià)值。此外，QuickFISH在鑒別不同真菌感染中也具有重要意義，能鑒別最常見(jiàn)的白念珠菌、副念珠菌及光滑念珠菌[21]。該技術(shù)仍存在一些局限，由于探針數(shù)量限制，只能識(shí)別常見(jiàn)病原菌，不能識(shí)別所有病原菌，且其不能提供藥敏信息，限制了其在臨床上的應(yīng)用。

1.3多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是指在同一PCR反應(yīng)體系中加上多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的反應(yīng)，該技術(shù)鑒別速度快，可在同一反應(yīng)內(nèi)同時(shí)檢測(cè)多種致病菌及耐藥基因，可識(shí)別24種病原菌，包括19種細(xì)菌、5種念珠菌，能檢測(cè)出甲氧西林（mecA）、萬(wàn)古霉素（vanA/B）和碳青霉烯（blaKPC）耐藥基因。FilmArray blood culture identification（BCID）是自動(dòng)化多重PCR平臺(tái)，集核酸提取、純化擴(kuò)增、檢測(cè)和分析為一體，可以在1 h內(nèi)從血培養(yǎng)陽(yáng)性的血樣本中識(shí)別病原菌，覆蓋90%以上的BSI致病菌。多項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究顯示，應(yīng)用該系統(tǒng)較血培養(yǎng)能更早獲得病原學(xué)信息，可更早對(duì)疑似BSI患者進(jìn)行目標(biāo)性抗菌治療，但其對(duì)臨床預(yù)后如死亡率、住院時(shí)間的改善不明顯[22-23]。Kang等[24]的研究結(jié)果顯示，該系統(tǒng)鑒定BSI病原菌總體敏感性可高達(dá)94.6%，在多重感染中敏感性則降至78.6%，提示其識(shí)別多重菌感染的敏感性不高，不能獲得所有病原菌信息。該技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌的mecA基因檢測(cè)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果，各項(xiàng)診斷研究中針對(duì)念珠菌感染的樣本較少，故需要更多大樣本研究以驗(yàn)證其價(jià)值。

1.4 DNA微陣列

DNA微陣列利用光導(dǎo)化學(xué)合成、固相表面化學(xué)合成等技術(shù)，在固相表面形成成千上萬(wàn)個(gè)寡核苷酸探針，與放射性同位素或熒光標(biāo)記的DNA或cDNA雜交，可識(shí)別目的基因及檢測(cè)基因表達(dá)水平，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病原體及耐藥基因。目前臨床已使用Verigene BC-GP、Verigene BC-GN核酸檢測(cè)技術(shù)，分別檢測(cè)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌。BC-GP可檢測(cè)出12種革蘭陽(yáng)性菌和3個(gè)耐藥基因，靈敏度達(dá)97.1%，特異度達(dá)100.0%;BC-GN能識(shí)別9種革蘭陰性菌和6種耐藥基因，靈敏度達(dá)98.0%，特異度達(dá)100.0%，兩者檢測(cè)時(shí)間僅需2.5 h。已有研究顯示，該技術(shù)能使疑似BSI的患者更早接受有效及最佳治療，縮短住院時(shí)間、降低住院死亡率[25]。有研究采用2 d抗生素變化率指標(biāo)衡量該技術(shù)對(duì)BSI患者的臨床效益，提示該法能快速提供病原信息、提供抗生素更改依據(jù)，在BSI患者抗生素方案指導(dǎo)上有重要意義[26]。該技術(shù)的局限是對(duì)混合菌感染檢測(cè)效果不佳，其主要原因?yàn)榘胁≡鷶?shù)量不足。且該技術(shù)依賴準(zhǔn)確的革蘭染色結(jié)果，如染色結(jié)果不準(zhǔn)確導(dǎo)致選擇了不對(duì)應(yīng)的系統(tǒng)，則會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

2 基于全血直接檢測(cè)的方法

2.1 實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR，qPCR）

實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)可直接在全血中檢測(cè)病原菌，免去血液培養(yǎng)這一耗時(shí)步驟，常見(jiàn)的如SeptiFast系統(tǒng)，使用針對(duì)細(xì)菌16S rDNA和真菌18S rDNA區(qū)域的通用引物進(jìn)行廣譜核酸擴(kuò)增，然后對(duì)來(lái)自陽(yáng)性血樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，能在6 h內(nèi)檢測(cè)出包括6種真菌在內(nèi)的25種病原體，同時(shí)還可檢測(cè)mecA耐藥基因，該技術(shù)可檢測(cè)小于1 mL的血標(biāo)本，避免了血培養(yǎng)需大量采集血液的缺點(diǎn)，對(duì)真菌的檢出限為100 CFU/mL，細(xì)菌的檢出限達(dá)3～30 CFU/mL[27]。研究顯示，SeptiFast系統(tǒng)較血培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率高13倍，且不受抗生素應(yīng)用的影響，對(duì)多種微生物感染的鑒定較血培養(yǎng)更有優(yōu)勢(shì)[28]。該法雖有減少檢出時(shí)間等優(yōu)勢(shì)，但其整體敏感性不高，在大樣本研究中，其敏感性僅有50%[29-30]，可能與血液中病原菌低于檢測(cè)限、靶DNA序列變異有關(guān)。既往隨機(jī)對(duì)照研究顯示，基于SeptiFast檢測(cè)的患者抗生素方案調(diào)整更迅速，能夠縮短抗菌藥物使用時(shí)間，但對(duì)患者的生存預(yù)后并無(wú)顯著改善，且不能獲得除mecA以外的耐藥基因信息，因此該法在臨床上的應(yīng)用仍存在局限[31]。Xpert MRSA/SA也是基于該技術(shù)的系統(tǒng)，主要通過(guò)檢測(cè)spa基因、mecA基因及金黃色葡萄球菌盒式染色體（SCCmec）在金黃色葡萄球菌的插入位點(diǎn)來(lái)鑒別MASA，其缺陷為引物和探針結(jié)合區(qū)存在突變或多態(tài)性可能會(huì)影響鑒定準(zhǔn)確性。研究顯示，該系統(tǒng)檢測(cè)能降低患者住院時(shí)間，但對(duì)降低患者住院死亡率證據(jù)不足。考慮到目前研究的樣本量有限，仍需進(jìn)一步進(jìn)行大型多中心研究明確該方法帶來(lái)的臨床效益。

2.2二代測(cè)序技術(shù)（Next-generation sequencing technology，NGS）

NGS也被稱為高通量并行測(cè)序，可快速對(duì)樣本中全部DNA或RNA進(jìn)行測(cè)序，能一次性對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行檢測(cè)，具有敏感性及特異性高、所需樣本量小等優(yōu)勢(shì)。目前認(rèn)為NGS作為一種新的BSI致病微生物檢測(cè)方法，Horiba等[32]的研究顯示，NGS能在BSI發(fā)病前7 d檢測(cè)到血液中的致病菌，提示該方法能夠提前預(yù)測(cè)患者發(fā)生BSI的潛力。另有小樣本研究提示，NGS技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性率是血培養(yǎng)的6倍，可致53%抗生素方案改變，即使不能獲得耐藥信息，也能帶來(lái)臨床獲益，如縮短患者住院時(shí)間、降低患者住院死亡率等[33]。同樣，NGS也存在局限性，如檢測(cè)費(fèi)用高、周期相對(duì)長(zhǎng)、不能檢測(cè)耐藥基因、需要專業(yè)團(tuán)隊(duì)等，尤其是檢測(cè)報(bào)告時(shí)間常需要2～3 d，但其對(duì)臨床少見(jiàn)菌的鑒定和新菌種的發(fā)現(xiàn)方面更具優(yōu)勢(shì)。

2.3 T2磁共振檢測(cè)（T2 magnetic resonance，T2MR）

T2MR是利用核磁共振（NMR）技術(shù)直接檢測(cè)全血中的病原菌，其原理是對(duì)病原體進(jìn)行特異性核酸擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與富含探針的超順磁性納米顆粒雜交，雜交會(huì)導(dǎo)致納米粒子聚集，如檢測(cè)到樣本的T2MR信號(hào)變化，提示存在待檢測(cè)的病原菌。所有步驟包括細(xì)胞裂解、靶DNA擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物T2MR檢測(cè)，均由T2Dx儀器自動(dòng)完成，該技術(shù)具有較高的臨床敏感性，能檢測(cè)到樣本中極少量的靶核酸，檢出限達(dá)1～3 CFU/mL，優(yōu)于PCR技術(shù)。一項(xiàng)納入140例疑似BSI患者血標(biāo)本的研究[34]比較了血培養(yǎng)和T2MR檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，T2MR技術(shù)檢測(cè)敏感性和特異性分別為83.3%和97.6%，報(bào)告結(jié)果時(shí)間僅需4～7 h，明顯優(yōu)于血培養(yǎng)。該技術(shù)除能檢測(cè)5種最常見(jiàn)的BSI細(xì)菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌）外，基于該技術(shù)的T2Candida還能檢測(cè)5種念珠菌（白色念珠菌、光滑念珠菌、副念珠菌、熱帶念珠菌和假絲酵母菌）。DIRECT2試驗(yàn)提示其靈敏度達(dá)89%，且不易受抗真菌治療的影響，該方法對(duì)縮短念珠菌檢測(cè)、菌種鑒定時(shí)間及改善真菌感染患者預(yù)后有重要意義[35]。但該技術(shù)存在局限，如檢測(cè)到病原菌種類較少、不能提供藥敏信息，且檢測(cè)費(fèi)用昂貴，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用困難，未來(lái)仍需更多研究克服上述局限性，發(fā)現(xiàn)改善BSI患者臨床預(yù)后的潛力。

2.4 滴液數(shù)字PCR技術(shù)

滴液數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（Droplet digital PCR，ddPCR）是不依賴額外標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行絕對(duì)定量的分子診斷技術(shù)。ddPCR技術(shù)將樣本分割成數(shù)萬(wàn)個(gè)微滴，利用微滴分析儀對(duì)每一個(gè)擴(kuò)增后的微滴進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)記錄的熒光信號(hào)幅度判斷微滴是否含待檢測(cè)的核酸靶分子，從而實(shí)現(xiàn)核酸靶分子的絕對(duì)定量。Wouters等[36]通過(guò)ddPCR技術(shù)檢測(cè)疑似BSI患者的血液樣本，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能在4 h內(nèi)鑒別陰性或陽(yáng)性細(xì)菌、真菌，且認(rèn)為ddPCR較其他分子診斷技術(shù)如SepsiTest具有更高的敏感性，適合極低含量目標(biāo)片段定量或定性檢測(cè)。但該技術(shù)鑒別真菌的敏感性相對(duì)較低，且該研究采用泛細(xì)菌、真菌引物，因此未能確定具體菌屬及藥敏信息。Zeng等[37]使用ddPCR技術(shù)，通過(guò)對(duì)引物的設(shè)計(jì)可進(jìn)一步確定菌屬及耐藥信息;通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)CpsE基因的ddPCR引物識(shí)別無(wú)乳鏈球菌，發(fā)現(xiàn)ddPCR具有高度敏感性、特異性及良好的重復(fù)性。Abram等[38]研發(fā)了名為IC3D的快速診斷系統(tǒng)，集合了ddPCR檢測(cè)技術(shù)和高通量三維粒子計(jì)數(shù)系統(tǒng)，可在1 h內(nèi)對(duì)全血標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏分析，檢出限達(dá)10 CFU/mL，對(duì)比報(bào)道中的qPCR檢出限1000 CFU/mL，具有更高的敏感度。該方法存在一定的局限性，如ddPCR檢測(cè)基于熒光探針，對(duì)引物特異性較高，且選擇不同的靶基因會(huì)影響檢測(cè)有效性，其高敏感度可能造成假陽(yáng)性結(jié)果，且目前仍需大型研究將ddPCR技術(shù)應(yīng)用到臨床BSI抗生素管理中，以明確其潛在的臨床價(jià)值。

綜上所述，當(dāng)前BSI的高發(fā)生率和高死亡率已得到廣泛關(guān)注。就診斷而言，血培養(yǎng)仍是診斷BSI的金標(biāo)準(zhǔn)，但血培養(yǎng)在快速診斷和檢測(cè)陽(yáng)性率低方面仍存在局限性。目前研究顯示，分子診斷對(duì)BSI病原學(xué)診斷具有較大潛力，隨著對(duì)微生物基因組學(xué)的深入了解和分子診斷技術(shù)的發(fā)展，相信未來(lái)人們能夠在數(shù)小時(shí)內(nèi)同步快速識(shí)別病原體及其耐藥基因。多種檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，可以提供可靠的BSI診斷結(jié)果，有效指導(dǎo)臨床合理用藥、及時(shí)診治、早期精準(zhǔn)地優(yōu)化抗感染方案、有效提高BSI患者的生存率。分子技術(shù)將成為BSI診治必不可少的重要工具。

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（收稿日期：2020-10-10）