龍賀明 程海燕 施華球 鄢 俊

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，贛州 341000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第五大常見惡性腫瘤，且發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢[1，2]。HCC是我國第三大癌癥死亡原因，嚴重威脅人類的生命健康，而HCC的復發(fā)和轉(zhuǎn)移是導致肝癌患者預后差的主要原因[3]。因此，研究HCC復發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找干預HCC復發(fā)及轉(zhuǎn)移性的分子靶標勢在必行。研究報道，腫瘤干細胞(tumor stem cell,TSC)是存在于腫瘤中具有自我更新和無限增殖能力的一類細胞，是腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移以及化放療抵抗的核心[4]，與腫瘤細胞的存活、增殖和復發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關[5]，由此，研究TSC的調(diào)控機制是治療腫瘤改善患者預后的關鍵。微小RNA(microRNA)是一類長度約19～25個核苷酸的小分子非編碼單鏈RNA，其通過結合靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達水平[6]，在癌癥中的細胞增殖、轉(zhuǎn)移及其他生物過程中起關鍵作用[7]。研究分析，miR-612在膀胱癌、結腸癌等多種腫瘤中低表達[8,9]，而miR-612在HCC中低表達促進HCC細胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[10]，miR-612在HCC中發(fā)揮的作用提示其可能與HCC的干細胞特性有關，因此本文以HCC細胞系為研究對象，研究miR-612對HCC干細胞特性的作用及機制，為miR-612作為治療HCC的候選靶標提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人HCC細胞系LM3、HepG2、Hep3B和人正常肝細胞系LO2均購自美國ATCC細胞庫；DMEM-F12培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒等均購自日本TaKaRa公司；miR-612 mimic、內(nèi)參GAPDH和CD133、Nanog的引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；脂質(zhì)體2000、TRIzol均購自美國Invitrogen公司；鼠抗人CD133抗體(ab19898)，兔抗人Nanog抗體(ab21624)，鼠抗人GAPDH抗體(ab8245)，BCA試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將細胞培養(yǎng)在 37℃、5%CO2全濕度培養(yǎng)箱中，LM3、HepG2培養(yǎng)基為10% FBS的DMEM-F12，Hep3B、LO2培養(yǎng)基為10% FBS的RPMI1640。HepG2細胞呈對數(shù)生長期時將細胞鋪至6孔板，貼壁24 h后，按說明書將脂質(zhì)體2000與對照scramble、miR-612 mimic轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至細胞中，分為對照組、miR-612 mimic實驗組，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2qRT-PCR檢測基因mRNA的表達 收集細胞，采用TRIzol法裂解細胞提取總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進行熒光定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參基因。每個樣品設置3個反應復孔，按兩步法進行反應，分析各樣品的循環(huán)閾值(threshold cycle，Ct)，用2-ΔΔCt法分析各組實驗數(shù)據(jù)。3次重復實驗。

1.2.3懸浮腫瘤球形成實驗檢測各組腫瘤細胞干性 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞以每孔500個細胞、200 μl培養(yǎng)基接種于96孔低吸附板中，每組設3個平行復孔，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從培養(yǎng)第3天開始每隔1 d在顯微鏡下觀察腫瘤球形成情況，培養(yǎng)2周時，腫瘤球長至較大時，顯微鏡下拍照。結果重復3 次。

1.2.4軟瓊脂克隆形成實驗檢測各組腫瘤細胞干性 將高壓滅菌后的1.2%軟瓊脂與20%DMEM F12培養(yǎng)基1∶1充分混勻后，每皿2 ml鋪至60 mm培養(yǎng)皿中為底層膠，放置室溫或4℃冰箱中冷卻至固態(tài)。同時將高壓滅菌后的0.6%軟瓊脂與20% DMEM F12培養(yǎng)基1∶1充分混勻為上層膠，取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞以每孔2×105個細胞、100 μl 培養(yǎng)基與37℃預熱的上層膠充分混勻后，鋪至固態(tài)的底層膠上，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d往皿中加入1 ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周時，腫瘤克隆球長至較大時，顯微鏡下拍照。結果重復3 次。

1.2.5Western blot檢測各組細胞蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，每孔加入500 μl的蛋白裂解液(含有5 μl的蛋白酶抑制劑和5 μl的磷酸酶抑制劑)，超聲裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心30 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，BCA試劑盒測蛋白濃度，煮沸變性后，每孔50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，8%脫脂牛奶封閉3 h，加入GAPDH和CD133、Nanog一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次后，二抗孵育室溫孵育2 h，ELC化學發(fā)光法曝光條帶，掃描拍照。蛋白條帶灰度值采用Quantity One V4軟件進行分析。結果重復3 次，做柱狀圖。

1.2.6熒光素酶報告基因試驗檢測miR-612與Nanog基因的靶向關系 將Nanog基因3′-UTR片段克隆至pGL3-Basic載體，構建pGL3-Basic-Nanog-3′-UTR報告基因質(zhì)粒，參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書的操作步驟，將miR-612 mimics/對照、pGL3-Basic-Nanog-3′-UTR(pGL3-Basic空載體為對照)、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染至HepG2細胞。48 h后，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書的操作步驟，進行檢測。計算pGL3-Basic-Nanog-3′-UTR報告基因質(zhì)粒的相對熒光素酶活性，即螢火蟲熒光素酶活性與內(nèi)參海腎熒光素酶的活性的比值。

表1 Real-time PCR引物序列

Tab.1 Real-time PCR primer sequences

GeneForward sequence(5'-3')Reverse sequence(5'-3')miR-612AACGTGGCTTATGAGTACCTCCAGTCGCCTTGTATCTGGAPDHTCTCTGCTCCTCCTGTTACTCCGACCTTCACCTTNanogTTTGTGGGCCTGAAGAAAACTAGGGCTGTCCTGAATAAGCAG

2 結果

2.1miR-612在HCC細胞系中的表達 收集HCC細胞LM3、HepG2、Hep3B和人正常肝細胞系LO2，提取細胞總的RNA，檢測miR-612在腫瘤細胞和正常細胞中的表達水平。qRT-PCR結果顯示miR-612在LM3、HepG2、Hep3B細胞中相對表達量分別為2.00±0.10、1.01±0.06、1.51±0.05，顯著低于在LO2中的相對表達量5.23±0.43(P值均<0.05)，見圖1。

2.2miR-612 mimic轉(zhuǎn)染HepG2細胞 轉(zhuǎn)染miR-612 mimic 48 h后，收集細胞，提取總RNA，qRT-PCR結果顯示，miR-612 mimic組miR-612的相對表達量為7.74±0.58，對照組miR-162的相對表達量為1.00±0.10，miR-612 mimic組miR-612表達顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.45，P=0.035)，見圖2。

2.3miR-612對HepG2干細胞特性的影響 懸浮腫瘤球形成實驗結果顯示，對照組和miR-612 mimic組腫瘤球形成的數(shù)目分別為(7±2.12)個、(3±1.57)個。實驗組的懸浮腫瘤球大小形成能力明顯低于對照組(P<0.05)，且實驗組的懸浮腫瘤球形態(tài)較小，轉(zhuǎn)染了miR-612 mimic的HepG2細胞，其懸浮腫瘤球形成能力明顯低于對照組，見圖3A。軟瓊脂克隆形成實驗結果顯示，對照組和miR-612 mimic組腫瘤克隆球形成的數(shù)目分別為(5±2.10)個、(2±1.04)個。實驗組的腫瘤克隆球形成能力明顯低于對照組(P<0.05)，且實驗組的腫瘤克隆球形態(tài)較小，轉(zhuǎn)染了miR-612 mimic的HepG2細胞，其軟瓊脂克隆形成能力明顯低于對照組，見圖3B。以上實驗結果表明，miR-612表達增加可顯著抑制HepG2干細胞的特性。

圖1 qRT-PCR法檢測miR-612在HCC細胞中的表達Fig.1 qRT-PCR assay for expression of miR-612 in HCC cellsNote:Compared with normal liver cell line LO2,*.P<0.05.

2.4miR-612對CD133和Nanog表達的影響 qRT-PCR實驗結果顯示，實驗組中CD133 mRNA的相對表達量為0.26±0.08，低于對照組(1.04±0.03)，Nanog mRNA的相對表達量為0.30±0.06，低于對照組(1.01±0.05)(P均<0.05)。見圖4A。

Western blot實驗結果顯示，實驗組中CD133 mRNA的相對表達量為0.12±0.04， 低于對照組(1.00±0.01)，Nanog蛋白的相對表達量為0.21±0.06，顯著低于對照組(1.01±0.05)(P均<0.05)，見圖4B。結果同Real-time PCR的結果一致，說明miR-612表達增加可以抑制CD133和 Nanog mRNA和蛋白表達。

圖2 qRT-PCR法檢測miR-612 mimic轉(zhuǎn)染HepG2細胞中miR-612的表達Fig.2 qRT-PCR assay for miR-612 mimic transfection of miR-612 in HepG2 cellsNote:Compared with control group,*.P<0.05.

圖3 miR-612對HepG2干細胞特性的影響Fig.3 Effect of miR-612 on characteristics of HepG2 stem cellsNote:A.Suspension tumor formation assay was performed to detect the formation of HepG2 cells tumor spheres after miR-612 mimic transfected;B.Soft agar colony formation assay was used to detect the formation of HepG2 cells cloned spheres after miR-612 mimic transfected.

圖4 miR-612 mimic轉(zhuǎn)染HepG2細胞后CD133和Nanog的mRNA和蛋白表達水平Fig.4 mRNA and protein expression levels of CD133 and Nanog in HepG2 cells transfected with miR-612 mimicNote:A.qRT-PCR detected CD133 and Nanog mRNA expression levels in cancer stem cells of HepG2 transfected with miR-612 mimic,*.P<0.05 compared with the control group;B.Western blot detected CD133 and Nanog protein expression levels in cancer stem cells of HepG2 transfected with miR-612 mimic.

圖5 各組的熒光素酶相對活性Fig.5 Relative activity of luciferase in each groupNote:Compared with the control group，*.P<0.05.

2.5各組HepG2細胞中的熒光素酶活性比較 雙熒光素酶報告基因試驗結果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-612 mimics、 pGL3-Basic-Nanog-3′-UTR報告基因質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40組HepG2細胞中的熒光素酶活性為0.29±0.04顯著低于共轉(zhuǎn)染對照、pGL3-Basic-Nanog-3′-UTR報告基因質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40組HepG2細胞中的熒光素酶活性1.00±0.20(P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染miR-612 mimics、 pGL3-Basic報告基因質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40組HepG2細胞中的熒光素酶活性(0.92±0.08)與共轉(zhuǎn)染對照、 pGL3-Basic報告基因質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40組HepG2細胞中的熒光素酶活性(0.92±0.08)之間無差異(P均>0.05)，見圖5。

3 討論

HCC是常見惡性腫瘤之一，嚴重危害人類生命健康[1]。隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，雖然對HCC的發(fā)病機制有了新的認識，手術、放化療及索拉菲尼靶向藥物等的聯(lián)合治療取得了一定的效果，但由于HCC復發(fā)轉(zhuǎn)移導致患者的低生存率并沒有好轉(zhuǎn)的趨勢[11，12]。近年來，一類具有自我更新能力和異質(zhì)性的干細胞樣細胞群(TSC)，具有體外促進腫瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和體內(nèi)成瘤的能力，被認為是腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的起始細胞[13]。已經(jīng)報道HCC存在TSC，并促進腫瘤的惡性行為[14]，因此抑制TSC可能成為治療腫瘤的新途徑，有望成為減少HCC患者復發(fā)轉(zhuǎn)移和改善患者預后的關鍵。

miRNAs作為高度保守的一類小分子非編碼單鏈RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達，參與調(diào)控細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡及TSC等多種相關信號通路[15，16]。在胃癌、肺癌等多種常見腫瘤中存在miRNAs表達譜異常[17，18]，同樣已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HCC存在眾多促進腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移異常表達的miRNAs，miRNAs具備的癌基因和抑癌基因作用引起廣大學者的密切關注[19，20]。最近研究表明miRNAs在調(diào)節(jié)腫瘤干細胞中發(fā)揮重要作用，miRNA-628通過靶向SOS1基因顯著抑制乳腺癌干細胞的遷移和侵襲[21]，miR-147低表達上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路促進結腸癌干細胞特性的表達[22]，以及miR-106b-5p通過PI3K/Akt途徑靶向PTEN，促進HCC干細胞維持和轉(zhuǎn)移[23]，因此miRNAs可以通過作用于腫瘤干細胞作為腫瘤治療的潛在靶點。

miR-612由于最近被鑒定出來，其研究較少，但是大部分研究集中在腫瘤，并在多種腫瘤中被證實其發(fā)揮抑癌基因的作用[24]，研究發(fā)現(xiàn)miR-612低表達與患者的黑色素瘤厚度、淋巴結轉(zhuǎn)移和較短生存期顯著相關，過表達顯著降低細胞增殖、集落形成和黑素瘤細胞的侵襲能力[25]。而Tao等[10]首次發(fā)現(xiàn)了HCC患者中miR-612的水平與腫瘤大小、分期、EMT和轉(zhuǎn)移呈負相關，其低表達可能在肝癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮促進的功能。miR-612與HCC干細胞的關系還尚未明確，因此本研究驗證了miR-612在HCC細胞株LM3、HepG2、Hep3B和肝正常上皮細胞株LO2中的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-612在LM3、HepG2、Hep3B中表達顯著低于LO2，其中HepG2表達的最低，表明miR-612低表達于HCC細胞中，與Tao等[10]的研究結果一致，本文選用表達最低的HepG2細胞作為工具細胞研究miR-612的生物學功能；采用miR-612 mimic轉(zhuǎn)染HepG2細胞進一步研究miR-612在HCC干細胞特性中發(fā)揮的作用，qRT-PCR法分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-612 mimic后細胞中miR-612表達明顯降低，TSC功能實驗顯示懸浮腫瘤球和軟瓊脂克隆形成能力顯著下降；CD133是HCC TSC常見標志物之一[26]，qRT-PCR和Western blot結果顯示轉(zhuǎn)染miR-612后細胞中CD133的mRNA和蛋白表達均降低。以上結果說明過表達miR-612后抑制HepG2細胞的干細胞特性，低表達的miR-612促進HCC細胞干細胞特性。

我們已經(jīng)觀察到miR-612抑制HepG2細胞干性的生物學現(xiàn)象，具體的作用機制還需進一步探討。在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)TSC自我更新和異質(zhì)性的轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和Nanog等，這些轉(zhuǎn)錄因子是維持TSC干細胞特性所必需的[27]，而Nanog在HCC組織中表達上調(diào)并與肝癌臨床病理特征相關， Nanog的下調(diào)明顯抑制HCC細胞的侵襲和遷移能力[28]，Toraih等[29]研究報道Nanog高表達有助于HCC細胞干性特征的獲得，是HCC治療的潛在分子。通常miRNA通過與靶基因的起始序列結合在轉(zhuǎn)錄后水平直接調(diào)節(jié)靶基因的表達。miR-612是否直接靶向調(diào)控Nanog，我們應用雙熒光素酶報告基因檢測結果發(fā)現(xiàn)miR-612直接靶向負調(diào)控Nanog基因。此外，采用qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR-612 mimic細胞中作為維持TSC功能的關鍵轉(zhuǎn)錄因子Nanog的表達水平，結果顯示高表達的miR-612抑制Nanog mRNA和蛋白的表達，表明miR-612在HepG2細胞中負調(diào)控Nanog，可能通過抑制Nanog的表達抑制HCC的干細胞特性。

綜上所述，miR-612在肝癌細胞系中低表達，過表達miR-612抑制HepG2細胞的干細胞特性，其可能通過抑制Nanog基因的表達。miR-612可作為抑制TSC治療HCC的潛在靶向分子，可以為干預和預防HCC提供實驗室數(shù)據(jù)和新的思路。