梁宇碩 陳穎盈 蔡潭溪 季 萍 胡 曄 程齊儉 王 穎

(上海市免疫學(xué)研究所，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025)

結(jié)核病(Tuberculosis)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)感染引起的慢性傳染性疾病。根據(jù)2018年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)結(jié)核病報告指出，我國在2017年約有90萬例新發(fā)結(jié)核，結(jié)核患病人數(shù)僅次于印度，高居全球第二位[1]。同時，近年來隨著多重耐藥結(jié)核患病人數(shù)的增加，各類結(jié)核病合并其他疾病(如艾滋病、糖尿病)的出現(xiàn)，對我國結(jié)核病的診斷和治療提出了新的挑戰(zhàn)[2]。但是，由于結(jié)核病病灶的空間特征，使其診斷和監(jiān)控難，雖然細菌學(xué)檢查(痰培養(yǎng)及痰涂片)是結(jié)核病臨床診斷的金標準，但其培養(yǎng)周期長、靈敏度較低，且假陰性多，目前臨床上僅有32%的肺結(jié)核是通過細菌學(xué)確診的[1]。而在抗結(jié)核治療中，即便在治療前細菌學(xué)檢測陽性的患者，往往在強化期結(jié)束后其痰培養(yǎng)或痰涂片結(jié)果也已經(jīng)轉(zhuǎn)陰，但其臨床病征并未消失，所以在結(jié)核病檢測和治療監(jiān)察中，痰液中結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)結(jié)果不甚理想[3]。

結(jié)核分枝桿菌感染宿主后，經(jīng)過呼吸道到達肺泡，并感染定植于肺泡的巨噬細胞[4]。感染的巨噬細胞和樹突狀細胞通過主要組織相容性抗原分子提呈M.tb抗原到T細胞，激發(fā)T細胞產(chǎn)生特異性更強的抗結(jié)核適應(yīng)性免疫應(yīng)答[5]，T細胞可以通過分泌干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-2等多種細胞因子激活或募集更多炎癥細胞對抗M.tb感染[6-8]。目前，基于結(jié)核感染過程中的免疫細胞分泌IFN-γ功能所建立的干擾素釋放實驗也成為目前臨床上結(jié)核病重要的輔助診斷手段。但是該方法一方面很難區(qū)分結(jié)核病和結(jié)核潛伏感染，同時其對于結(jié)核病治療過程中的診斷意義也需要進一步的實驗數(shù)據(jù)證明，而其中核心的未解決的問題在于目前尚不能確定不同患者在治療過程中抗原特異性IFN-γ分泌水平與結(jié)核病原菌荷載之間的關(guān)系。

最近，基于Protein A磁珠免疫沉淀富集聯(lián)合質(zhì)譜檢測外周結(jié)核特異性抗原方法的建立為結(jié)核合并艾滋病患者診斷提供新方法。該方法利用Protein A磁珠免疫沉淀富集了患者血漿中由結(jié)核分枝桿菌分泌的特異性抗原CFP-10酶切后的短肽1593(肽段：TDAATLAQEAGNFER;質(zhì)荷比m/z 1593.75)，并通過引入同位素標記的目標肽段降低抗原抗體結(jié)合效率的誤差，最后通過質(zhì)譜分析方法檢測目標抗原的含量[9]。同時有研究發(fā)現(xiàn)在無艾滋病毒感染的結(jié)核病患者中，1593的檢出與定量在結(jié)核病的快速診斷中起著重要的作用[10]。因此，該方法有效提高了M.tb檢出效率，并具有較高的特異性，為檢測患者在抗結(jié)核治療過程中病原學(xué)特征提供新方案。目前，該方法是否可用于檢測結(jié)核病治療過程中外周抗原的動態(tài)變化還未知曉。

為此，本研究擬同步分析活動期結(jié)核病患者在抗結(jié)核治療過程的外周M.tb抗原水平與抗原特異性細胞免疫應(yīng)答的水平，并進行相關(guān)性分析，一方面為結(jié)核病治療中的免疫動態(tài)變化提供病原學(xué)基礎(chǔ)，另一方面也為抗結(jié)核治療監(jiān)控提供了新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本來源 本研究共納入40例活動性結(jié)核病患者，患者均來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，所有患者同意并簽署知情同意書?；颊呷虢M時間2012年10月至2016年5月。結(jié)核病的診斷標準為微生物學(xué)檢查M.tb涂片或者M.tb培養(yǎng)陽性，同時結(jié)合病史、癥狀、體征、影像學(xué)檢查(X射線或CT)等輔助診斷以及住院期間的抗結(jié)核治療效果確診。其中年齡大于80歲的患者，合并了乙肝、艾滋病等其他感染性疾病的患者均予以剔除；同時部分入組的患者跟蹤遺失或樣本遺失，最終有6例患者完整收集了治療前及治療中1、2、4、5、6個月的25例外周血樣本用于本研究分析，并記錄患者痰培養(yǎng)、痰涂片信息、臨床癥狀和病情的轉(zhuǎn)歸。

1.1.2實驗材料、試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、淋巴細胞分離液均購自美國Life Technology公司；丙二醇甲醚酸樹脂(PMA)和離子霉素(ionomycine)購自美國Sigma公司；96孔U底板購自美國BD公司；Pacific Blue-鼠抗人CD3、Perc P-鼠抗人CD8、FITC-鼠抗人IFN-γ抗體、PE-鼠抗TNF-α抗體和細胞破膜試劑盒均購自BD Bioscience公司；碳酸氫銨(pH7.8)、甲酸購自美國Sigma公司；特異性增強胰蛋白酶購自Promega公司；1593特異性多克隆抗體和1593同位素標記肽段(質(zhì)荷比1,603.6)均購自GenScript公司；Dynabeads-Protein A磁珠和Crosslinker均購自Thermo Fisher。

1.2方法

1.2.1人外周血單個核細胞分離 取結(jié)核病患者外周血5 ml，肝素抗凝，收集血漿保存于-80℃，并經(jīng)淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離獲得PBMCs，臺盼藍染色計數(shù)后，重懸于含10% FBS、氨芐青霉素和硫酸鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，計數(shù)，調(diào)整細胞至工作濃度。

1.2.2血漿的酶切 在0.1 ml血漿中加入0.4 ml 10-7mol/L的碳酸氫氨溶液，加入10 μg胰蛋白酶進行酶切。渦旋振蕩，溶液充分混勻后，1 200 W微波爐設(shè)置為20%火力，均勻加熱5 min，重復(fù)此加熱步驟6次。微波酶切后，將樣本置入37℃恒溫搖床中混勻孵育16～20 h。

1.2.3Dynabeads-Protein A磁珠的活化和1593特異性抗體的連接 取200 μl磁珠于Ep管中，磁力架上棄上清。加入500 μl PBST(pH=7.4；PBS加0.05% Tween-20)，渦旋混勻后，在磁力架上棄上清?；罨蟮拇胖榕c50 μg 1593特異性抗體在200 μl PBS 37 ℃孵育30 min后，500 μl PBST重懸洗滌2次。洗滌后，磁珠用200 μl PBS重懸備用。

1.2.4抗體與Dynabeads-Protein A磁珠的化學(xué)連接 超純水配置含0.02 mol/L磷酸鈉和0.15 mol/L氯化鈉(pH=7.4)的溶劑一和含1 mol/L Tris 鹽酸(pH=7.5)的溶劑二。備用磁珠用500 μl溶液一洗滌2次。洗滌后，磁珠與500 μl稀釋至0.5 mol/L的BS3室溫孵育30 min后加入25 μl溶劑二終止反應(yīng)。PBST(PBS加0.05% Tween-20)洗滌磁珠2次。磁珠用200 μl PBS重懸備用。

1.2.5抗體連接的Dynabeads-Protein A磁珠預(yù)處理及與樣本孵育 200 μl 1% 甲酸與交聯(lián)后的磁珠在室溫下共孵育15 min。置于磁力架上棄上清，加入500 μl PBST洗滌1分鐘，渦旋混勻后棄上清。重復(fù)洗滌3次。磁珠用200 μl PBST重懸。同時將20 μl 磁珠和2.5 nmol/L的1593同位素肽段(1603)加入酶切后的樣品，充分混勻后在4℃搖床中孵育16～20 h。孵育后磁珠置于磁力架上，棄上清。加入 500 μl PBST洗滌1 min，充分混勻后，棄上清。重復(fù)洗滌2次。加入500 μl PBS洗滌1 min，充分混勻后，棄上清。重復(fù)洗滌3次?？焖匐x心后，置于磁力架上，棄上清。20 μl 1% 甲酸洗脫磁珠上的目標肽段。離心，將上清轉(zhuǎn)移到新的Ep管中。21 130 g離心20 min，室溫。將上清轉(zhuǎn)移至新Ep管中。重復(fù)離心1次。上清轉(zhuǎn)移至液相質(zhì)譜上樣管中。三重四極管高效液相色譜儀檢測樣本，經(jīng)過Skyline進行分析，同時抗原肽反應(yīng)性=目標肽段(1593)/同位素標記肽段(1603)，以減少批次間的誤差。

1.2.6胞內(nèi)細胞因子的檢測 將PBMCs以1×106個/200 μl每孔接種于96孔U底板中，分別加入PMA/IONO(陽性對照)和抗原(CFP-10)進行刺激，其中PMA/IONO組培養(yǎng)6 h，并同時加入Golgi Stop；抗原刺激組于37℃培養(yǎng)20 h，培養(yǎng)結(jié)束前6 h加入Golgi Stop。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，先行使用Pacific Blue-鼠抗人CD3抗體和Perc P-鼠抗人CD8抗體進行表面標志染色，于4℃避光孵育30 min后，用FACS buffer(含2% FBS的PBS)洗滌2遍，加入破膜固定劑，4℃孵育20 min；破膜洗滌液洗滌2次，加入工作濃度的FITC-鼠抗人IFN-γ和PE-鼠抗人TNF-α抗體進行胞內(nèi)染色，4℃避光孵育30 min；破膜洗滌液洗2次，用PBS重懸細胞，F(xiàn)ACS CantoⅡ流式細胞儀收集細胞，并采用Flow Jo軟件分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 實驗結(jié)果統(tǒng)計分析用Microsoft Excel，Graphpad 6.0進行統(tǒng)計分析。相關(guān)性分析運用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1結(jié)核患者臨床用藥及治療信息 目前我國抗結(jié)核治療主要采取規(guī)范化的治療方案，即前2個月為四藥聯(lián)用的加強期(異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇)，4個月兩藥聯(lián)用的鞏固期(異煙肼、利福平)[11]。根據(jù)臨床診斷，在本次入組的6例患者中，1例患者在治療6個月后結(jié)束治療，1例患者在治療7個月后結(jié)束治療，余下4例患者的治療周期均大于或等于9個月(表1)。6例患者在治療前的痰培養(yǎng)陽性為5例，1例為陰性；經(jīng)過2個月強化期治療后痰培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，并直至治療結(jié)束(表2)。

表1 6例跟蹤患者臨床用藥信息

Tab.1 6 tracked TB patients clinical medication information

No.0 month1 month2 months4 months6 months7 months8 months9 months1HRZEHREHREHREND2HREHREHREHRHRHRHREND3HRZEHRZEHRZEHRHREND4HRZEHRZEHRZEHREHRHRHREND5HRZEHRZEHRHRHRHRHRHR6HRZEHRZEHREHRHRHRHREND

Note：H.Isoniazid;R.Rifampin;Z.Pyrazinamide;E.Ethambutol.

2.2結(jié)核患者治療過程中的外周結(jié)核特異性抗原CFP-10含量的動態(tài)變化 在本研究中，我們通過Dynabeads-Protein A磁珠富集結(jié)核病跟蹤患者外周血漿中結(jié)核特異性肽段，并利用高效液相色譜法分析CFP-10肽段與同位素標記肽段的反應(yīng)性(圖1A)，結(jié)果顯示，1～5號結(jié)核病患者在治療前CFP-10 的水平相當，但是在治療過程中的變化趨勢不盡相同，其中患者1和患者4的結(jié)核特異性抗原水平隨著治療的進程，均有明顯下降；其他4例患者的抗原水平在治療6個月后仍然處于相當?shù)乃剑憩F(xiàn)為下降并不明顯，其中患者6的外周CFP-10的水平在整個治療過程中均處于較高水平(圖1B)，上述結(jié)果表明外周血漿中結(jié)核菌抗原在治療過程中的動態(tài)變化均在個體差異。

表2 6例患者治療過程中痰涂片結(jié)果

Tab.2 6 patients with sputum smear results during treatment

No.0 month2 months6 months1+--2+--3+--4+--5---6+--

Note：+.Sputum smear positive;-.Sputum smear negative.

2.3結(jié)核患者治療過程中CFP-10特異性IFN-γ+CD4+T細胞數(shù)量的動態(tài)變化 早前的研究發(fā)現(xiàn)在抗結(jié)核過程中，CD4+T細胞是主要的抗感染免疫效應(yīng)細胞[12]， Th1型細胞能通過分泌IFN-γ發(fā)揮抗感染作用。本研究通過流式細胞法分析患者PBMCs中結(jié)核特異性抗原CFP-10刺激下IFN-γ分泌細胞數(shù)量的百分比，結(jié)果顯示CFP-10特異性IFN-γ+CD4+T細胞的比例變化與CFP-10在外周血漿中的含量相似，在治療過程中呈現(xiàn)不同程度的浮動。與CFP-10的動態(tài)改變相似，患者1和患者4的IFN-γ+Th1細胞比例在治療早期就呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，患者2和患者5中的IFN-γ+Th1細胞比例在治療早期呈現(xiàn)上升趨勢，但是隨著治療的進行，則呈現(xiàn)下降趨勢，而患者3和患者6的IFN-γ+Th1細胞比例的動態(tài)變化趨勢不明顯(圖2B)，上述結(jié)果提示IFN-γ+Th1細胞比例在結(jié)核治療過程中的動態(tài)變化同樣具有個體差異性。

2.4結(jié)核患者治療過程中的CFP-10含量的變化與CFP-10特異性IFN-γ+CD4+T細胞比例的相關(guān)性分析 我們通過分析抗結(jié)核治療過程中M.tb特異性CFP-10在外周血漿中的動態(tài)變化與CFP-10特異性IFN-γ+CD4+T細胞比例，發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞分泌IFN-γ的水平與結(jié)核菌抗原在外周的變化趨勢具有部分一致性(圖3A)，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)兩者存在顯著性相關(guān)(P<0.05)。

2.5結(jié)核患者治療過程中CFP-10特異性TNF-α分泌CD4+T細胞數(shù)量的動態(tài)變化 TNF-α是重要的炎癥因子，在抗結(jié)核感染過程中，TNF-α能通過誘導(dǎo)已吞噬M.tb的巨噬細胞凋亡發(fā)揮抗感染作用。我們通過流式細胞法分析患者外周PBMCs中CFP-10刺激下TNF-α+CD4+T細胞比例的動態(tài)變化(圖4A)，結(jié)果顯示：患者1和患者6的TNF-α+CD4+T細胞的比例在治療初期大幅度下降，并在治療3個月后維持在較低水平；患者2的CD4+T細胞分泌TNF-α的水平在治療初期有明顯上升，但在治療3個月后呈現(xiàn)逐步下降的趨勢；余下3例患者的TNF-α+CD4+T細胞比例的動態(tài)變化趨勢不明顯(圖4B)。上述結(jié)果提示了TNF-α+CD4+T細胞比例在結(jié)核治療過程中動態(tài)變化同樣具有個體差異性。

圖1 肺結(jié)核患者治療過程中血漿游離CFP-10的動態(tài)變化

Fig.1 Dynamics of CFP-10 burden in peripheray of TB patients receiving anti-TB treatment

Note: A.Representitive of Skyline's analysis of CFP-10 in the peripheray of TB patients receiving anti-TB treatment;B.Dynamics of CFP-10 burden in the peripheray of TB patients receiving anti-TB treatment.

圖2 結(jié)核患者在抗結(jié)核治療中CFP-10特異性IFN-γ+CD4+T細胞的比例變化Fig.2 Dynamics of IFN-γ releasing CD4+T cell in TB patients receiving anti-TB treatmentNote:A.Representitive of IFN-γ producing CD4+T cells by flow cytometry;B.Dynamics of IFN-γ+CD4+T cell in TB patients receiving anti-TB treatment.

圖3 結(jié)核患者在抗結(jié)核治療中CFP-10和CFP-10特異性IFN-γ+CD4+T細胞的比例變化Fig.3 Dynamics of CFP-10 burden and CFP-10 specific IFN-γ+CD4+T cell percentage in TB patients receiving anti-TB treatmentNote:A.Dynamics of CFP-10 burden and corresponding CFP-10 specific IFN-γ+CD4+T cell percentage during anti-TB treatment in 6 active TB patients;B.The correlation between CFP-10 burden and CFP-10 specific IFN-γ+CD4+T cell percentage in TB patients receiving anti-TB treatment.

圖4 結(jié)核患者在抗結(jié)核治療中CFP-10特異性TNF-α+CD4+T細胞的比例變化Fig.4 Dynamics of TNF-α+CD4+T cell in TB patients receiving anti-TB treatmentNote:A.Representitive of TNF-α producing CD4+T cells by flow cytometry;B.Dynamics of TNF-α+CD4+T cell of TB patients receiving anti-TB treatment.

圖5 結(jié)核患者在抗結(jié)核治療中CFP-10和CFP-10特異性TNF-α+CD4+T細胞的比例變化Fig.5 Dynamics of CFP-10 burden and CFP-10 specific TNF-α+CD4+T cell percentage of TB patients receiving anti-TB treatmentNote:A.Dynamics of CFP-10 burden and corresponding CFP-10 specific TNF-α+CD4+T cell percentage during anti-TB treatment in 6 active TB patients;B.The correlation between CFP-10 burden and CFP-10 specific TNF-α+CD4+T cell percentage in TB patients receiving anti-TB treatment.

2.6結(jié)核患者治療過程中CFP-10含量的變化與CFP-10特異性TNF-α+CD4+T細胞比例的相關(guān)性分析 分析CFP-10含量的變化與CFP-10特異性TNF-α+CD4+T細胞比例的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在患者治療期間TNF-α+CD4+T細胞的比例與CFP-10含量的變化趨勢并不一致(圖5A)，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，釋放TNF-α的CD4+T細胞比例與外周血中M.tb的含量變化無相關(guān)性(P>0.05，圖5B)。

3 討論

結(jié)核病的治療過程中，結(jié)核菌荷載可以直接反映患者接受抗結(jié)核治療的有效性，而機體內(nèi)抗結(jié)核免疫反應(yīng)水平的動態(tài)變化則是間接的生物標志，在以往的研究中，尚沒有關(guān)于兩者之間相關(guān)性的直接證據(jù)。本研究則利用高靈敏度的高效液相色譜測定了患者在抗結(jié)核治療中M.tb特異性抗原CFP-10的動態(tài)變化，并同步測定了CFP-10特異性細胞免疫應(yīng)答的動態(tài)改變，以此獲得了機體內(nèi)CFP-10特異性細胞免疫應(yīng)答水平和抗原荷載的相關(guān)性，以期為抗結(jié)核細胞免疫應(yīng)答水平提供病原學(xué)依據(jù)。

本研究納入的6例結(jié)核病患者均接受規(guī)范化的DOTS治療方案，即前2個月四藥聯(lián)用的加強期(異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇)，和4個月兩藥聯(lián)用的鞏固期(異煙肼、利福平)，并根據(jù)疾病臨床表現(xiàn)決定是否延長。對在此治療過程中外周CFP-10抗原肽的檢測結(jié)果顯示，CFP-10含量在抗結(jié)核治療過程中的變化趨勢在個體間差異較大，包括有持續(xù)下降(患者1和4)，逐步上升(患者2和5)和基本持平(患者3和6)等三種情況。事實上，治療前和治療過程中目前常規(guī)的菌培養(yǎng)的檢測方法只能定性，而非定量，而本研究中的方法則可以實現(xiàn)外周病原抗原更好的定量。在本研究中患者6在治療前的抗原水平明顯高于其他患者，但是在臨床上目前的檢測方法很難獲得類似的結(jié)果。此外，在治療過程中CFP-10抗原肽的動態(tài)變化在個體間的差異也可能與患者藥物治療后病原菌釋放的抗原在人體內(nèi)的持留有關(guān)。

已有的研究充分表明CD4+T細胞作為抗結(jié)核免疫應(yīng)答的重要組成[13]，在藥物治療過程中的免疫動態(tài)變化特征則可以很好地反映病原菌的清除[14]。我們分析了6例患者在抗結(jié)核治療前和治療1、2、3、4、5、6個月過程中分泌IFN-γ和TNF-α的CD4+T細胞比例的動態(tài)變化后，結(jié)果顯示：不同的細胞因子在治療過程中分泌水平的變化趨勢不完全相同。在抗結(jié)核治療6個月后，CD4+T細胞中上述兩個細胞因子的水平在5例患者中都有不同程度的減少；而在余下的1例患者中，兩個細胞因子均有不同程度的增長。

機體在結(jié)核菌的刺激下能活化T細胞釋放IFN-γ和TNF-α等多種細胞因子，發(fā)揮抗感染作用。這些細胞因子在結(jié)核病的發(fā)展和治療中能誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的免疫學(xué)效應(yīng)[15]。IFN-γ作為一種重要的結(jié)核應(yīng)答細胞因子，可以進一步激活單核巨噬細胞，促使巨噬細胞活化并產(chǎn)生一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)殺滅結(jié)核分枝桿菌[16]。研究發(fā)現(xiàn)，3例患者IFN-γ+CD4+T細胞的比例在前期治療中有顯著性下降；而在有治療2月前(治療前和治療1個月)數(shù)據(jù)的5例患者中，4例患者的Th1細胞在治療2個月時有顯著性回升。隨著抗結(jié)核治療，結(jié)核特異性抗原的變化趨勢與Th1細胞的水平有一定的相關(guān)性。

TNF-α可以通過募集免疫細胞聚集和黏附形成肉芽腫，隔離結(jié)核分枝桿菌感染區(qū)域；TNF-α能誘導(dǎo)已吞噬結(jié)核分枝桿菌的巨噬細胞凋亡，激活炎癥介質(zhì)。但TNF-α作為促炎細胞因子，對結(jié)核分枝桿菌的控制有雙向作用，有研究發(fā)現(xiàn)高水平的TNF-α會減少對結(jié)核分枝桿菌活性的抑制作用，加重患者病情[17]。隨著結(jié)核病情加重，TNF-α水平也隨之升高[13]。因此，TNF-α在抗結(jié)核治療中有著重要地位，或許能成為療效鑒別的重要生物指標。我們的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α+與IFN-γ+CD4+T細胞水平在治療期間的反復(fù)性變化不同，TNF-α+CD4+T細胞的比例在6例患者中有4例隨著治療過程有顯著降低，提示了TNF-α在抗結(jié)核中的保護作用。而其與外周CFP-10抗原含量之間的無相關(guān)性則提示TNF-α+CD4+T細胞的水平可能還有抗原以外的其他因素影響。

綜上所述，本研究通過高靈敏度的高效液相色譜測定結(jié)核患者在抗結(jié)核治療中M.tb抗原CFP-10的動態(tài)變化，并同步運用流式細胞法檢測了CFP-10刺激下細胞免疫反應(yīng)的動態(tài)改變，發(fā)現(xiàn)了CFP-10在抗結(jié)核治療過程中動態(tài)變化的個體差異性，而這些抗原肽的動態(tài)變化與外周IFN-γ+CD4+T細胞比例呈現(xiàn)正相關(guān)，與TNF-α+CD4+T細胞的比例無關(guān)聯(lián)性，提示我們目前所采用的IFN-γ釋放實驗?zāi)撤N程度上可以反映患者外周結(jié)核分枝桿菌抗原的載量，而TNF-α+CD4+T細胞的水平則與抗原水平的關(guān)系一致性較差，上述基于結(jié)核病原學(xué)和機體免疫應(yīng)答水平的同步檢測，對于進一步解析抗結(jié)核免疫應(yīng)答的病原學(xué)驅(qū)動因素，建立新型抗結(jié)核治療療效評價的生物標志物提供前期理論依據(jù)。后續(xù)將進一步治療跟蹤樣本進行擴大研究。