雷康藤，龍娟娟，楊琳妹，張毛毛，鈕谷雨，張 培

(滁州學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 滁州 239000)

菊花為菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序，氣清香，味甘、微苦。具有散風(fēng)清熱，平肝明目，清熱解毒之功效。按照產(chǎn)地和加工方式的不同，具有“亳菊”、“滁菊”、“貢菊”、“杭菊”、“懷菊”等多種類型[1]。

黃酮類化合物是菊花的主要有效成分之一，具有廣泛的藥理活性，如抗氧化活性、抗腫瘤活性等[2]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)菊花的研究主要集中在黃酮類化合物的提取、含量測(cè)定及初步活性研究，而作為黃酮類化合物重要特性的各黃酮種類及其含量與活性間的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道[3-4]。此外，目前對(duì)菊花黃酮類化合物的研究通常是對(duì)某產(chǎn)地單一品種菊花開展獨(dú)立研究，鮮見將不同產(chǎn)地、不同品種菊花進(jìn)行系列研究與比較的報(bào)道，故難以發(fā)現(xiàn)其中的規(guī)律及黃酮類化合物產(chǎn)生功效的作用機(jī)制。

基于此，收集來(lái)自六個(gè)不同產(chǎn)地的菊花，提取黃酮類化合物，測(cè)其總黃酮含量，采用HPLC法分析各黃酮類化合物種類及含量，采用DPPH法測(cè)其清除自由基能力，以偏最小二乘法(PLS)分析不同菊花中黃酮類化合物成分與清除DPPH自由基間的相關(guān)性，探究各黃酮類化合物對(duì)體外抗氧化活性間的影響，以期為不同產(chǎn)地菊花中黃酮類化合物功效評(píng)價(jià)及黃酮類化合物與體外抗氧化活性間的關(guān)系提供理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

無(wú)水乙醇(無(wú)錫市展望化工有限公司)； DPPH(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)；黃芩苷(PS010446)、槲皮素(PS010461)、芹菜素(PS010177)對(duì)照品均購(gòu)于成都普思生物科技有限公司；綠原酸(110753-201817)、蘆丁(100080-201811)對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。菊泰滁菊1號(hào)樣品、菊泰滁菊2號(hào)樣品、杭白菊、亳菊、福建胎菊、河南胎菊均購(gòu)于滁州百姓緣大藥房。

分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；Cary 100 Scan 紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)Varian公司)；高效液相色譜儀(Agilent 1200型)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同產(chǎn)地菊花中黃酮化合物的提取

分別稱取10 g左右六種干燥菊花(杭白菊，亳菊，福建胎菊，河南胎菊，滁菊1號(hào)，滁菊2號(hào))加入100 mL 70% 乙醇溶液，于60℃加熱回流提取2次，每次2 h，合并兩次提取液。于50℃旋蒸至無(wú)液體旋出。加入20 mL去離子水混懸，加石油醚進(jìn)行萃取，濃縮，低溫干燥，稱重，計(jì)算提取率。

菊泰滁菊1、菊泰滁菊2、河南胎菊、亳菊、杭白菊、福建胎菊的黃酮化合物的提取率分別為33.89%、35.54%、21.44%、36.09%、32.72%和18.06%。六種菊花中，亳菊的黃酮的提取率最高，福建胎菊最低。

2.2 不同產(chǎn)地菊花黃酮化合物總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取0.0200 g蘆丁，60%乙醇定容于50 mL容量瓶中，搖勻，即得0.4 mg/mL蘆丁對(duì)照液；從對(duì)照液中準(zhǔn)確移取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL分別置于7個(gè)25 mL容量瓶中；將每個(gè)容量瓶用60%乙醇迅速補(bǔ)加至6 mL；向各容量瓶中分別加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，放置6 min后，加入1 mL 10%的硝酸鋁，放置6 min后加入10 mL 4%氫氧化鈉，用60%的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15 min；于503 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)蘆丁對(duì)照品濃度和吸光度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Y=10.48X-0.002(X:mg/mL，R=0.9990)，線性范圍為0.016～0.096 mg/mL。

2.2.2 樣品總黃酮含量的測(cè)定

稱0.5 g左右各菊花黃酮類化合物提取物用60%乙醇溶液溶解，定容至10 mL。精密移取0.10 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中，用60%乙醇補(bǔ)加至6 mL。其它操作按“標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”步驟進(jìn)行，測(cè)其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算菊泰滁菊1、菊泰滁菊2、河南胎菊、亳菊、杭白菊、福建胎菊的黃酮化合物的總黃酮含量分別為12.50%、11.74%、9.47%、18.66%、23.05%和30.30%。六種菊花中，總黃酮含量最高的福建胎菊，最低的是河南胎菊。

2.3 不同產(chǎn)地菊花黃酮化合物種類及含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件[5-6]

使用 Agilent 1200型高效液相色譜儀進(jìn)行分析。色譜柱：依利特sinopak C18(4.6 mm×250 mm，5 L)；流動(dòng)相：甲醇-0.2%乙酸(65∶35)，流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm，柱溫: 25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 混合對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備

精密稱取黃芩苷5.2 mg，槲皮素5.2 mg，綠原酸5.2 mg，芹菜素5.3 mg，蘆丁5.2 mg，加甲醇溶解并定容于10 mL，制得混合對(duì)照品溶液。

精密稱定各菊花黃酮類化合物提取物適量，加甲醇溶解并定容于25 mL，得供試品溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察

精密移取各混合對(duì)照品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、1.20、2.4 mL至5 mL容量瓶中，用甲醇定容，得不同濃度的混合對(duì)照品溶液，分別注入液相色譜儀，得色譜圖，如圖1A所示，每種黃酮類化合物在色譜中均為單峰。以各黃酮對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)( X：mg/mL)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，做回歸方程，結(jié)果如表1所示。

圖1 黃酮混合對(duì)照品(A)和菊花中黃酮化合物樣品(B)HPLC圖
Fig.1 HPLC chromatograms of mixture standards (A) and Chrysanthemum (B)

表1 各黃酮化合物線性關(guān)系及檢出限Table 1 Regression equations,linear range and LODs of the five investigated compounds

2.3.4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.3”項(xiàng)下“色譜條件”連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，計(jì)算得黃芩苷、槲皮素、綠原酸、芹菜素、蘆丁的峰面積 RSD 分別為3.16%、1.56%、0.65%、3.45%、1.80%，表明儀器精密度較好。

取同一菊花供試品，按“2.3”項(xiàng)下“色譜條件”連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，計(jì)算得黃芩苷、槲皮素、綠原酸、芹菜素、蘆丁的峰面積 RSD 分別為2.55%、0.99%、0.53%、2.62%、0.83%，表明方法重復(fù)性較好。

對(duì)照品溶液置于 4℃ 冰箱中，分別在 0、12、24 h 后，按“2.3”項(xiàng)下“色譜條件”測(cè)定。經(jīng)測(cè)定得到綠原酸、蘆丁、黃芩苷、槲皮素、芹菜素的峰面積的RSD 依次為1.94%、1.94%、3.93%、4.01%、3.44%，說(shuō)明對(duì)照品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 含量測(cè)定

取各供試品溶液，分別按“2.3”項(xiàng)下“色譜條件”進(jìn)樣，色譜圖如圖1B所示。記錄各峰面積，代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算六種菊花樣品中黃芩苷、槲皮素、綠原酸、芹菜素、蘆丁的含量測(cè)定結(jié)果見表2。從表2可以看出,在不同來(lái)源的菊花樣本中5種成分含量有明顯的差異,其中綠原酸含量變異范圍較大。根據(jù)中國(guó)藥典要求，菊花中綠原酸的含量不應(yīng)低于0.2%[1]，本實(shí)驗(yàn)中六種菊花的綠原酸含量均高于0.63%，符合藥典要求。

表2 各菊花中黃酮化合物含量測(cè)定結(jié)果 %Table 2 Content determination results of flavonoids in different Chrysanthemums

2.4 不同產(chǎn)地菊花黃酮化合物DPPH自由基清除能力測(cè)定[7]

分別準(zhǔn)確稱取各產(chǎn)地菊花黃酮化合物3.0 mg，加入60%乙醇溶解并定容至25 mL，得樣品溶液。分別取1.5 mL各黃酮化合物樣品溶液于試管中，加入4.5 mL DPPH(0.1045 mmol/L)溶液，室溫避光反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇作為空白實(shí)驗(yàn)，在517 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度。按下式分別計(jì)算DPPH自由基清除率。平行實(shí)驗(yàn)3次。

自由基清除率=[A0-(As-Ac)]/A0

式中：A0為1.5 mL蒸餾水+4.5 mL DPPH溶液的吸光度；As為1.5 mL樣品溶液+4.5 mL DPPH溶液的吸光度；Ac為1.5mL樣品溶液+4.5 mL無(wú)水乙醇的吸光度。

測(cè)定不同產(chǎn)地菊花黃酮化合物對(duì)DPPH自由基的清除能力并以抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果見圖2。由圖可知不同產(chǎn)地菊花黃酮化合物對(duì)DPPH自由基的清除率不同，福建胎菊DPPH自由基清除率相對(duì)較高，為73.03%，杭白菊和亳菊DPPH自由基清除率都在50%以上，河南胎菊DPPH自由基清除率為43.65%，來(lái)自同一地區(qū)的滁菊1號(hào)樣品和滁菊2號(hào)樣品的DPPH自由基的清除率相差不大，分別為：39.51%，36.88%，相對(duì)較低。

圖2 各菊花中黃酮化合物對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.2 The antioxidant activities against DPPH radicals of flavonoids in different Chrysanthemums

2.5 相關(guān)性分析

由表2 及圖1可知，菊花黃酮主要由綠原酸、黃芩苷、蘆丁、芹菜素、槲皮素組成，但不同產(chǎn)地的菊花黃酮，其成分的量及對(duì)抗氧化活性均有所不同。為明確每種成分及量與抗氧化活性間是否有關(guān)聯(lián)，利用Simca-p 11.5軟件采用PLS分析法對(duì)菊花黃酮的成分種類及量與其對(duì)抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)性分析，探討兩者的關(guān)系。以菊花黃酮成分組成為獨(dú)立變量(X)，以菊花黃酮成分對(duì)抗氧化活性的抑制率作為因變量(Y)，采用PLS進(jìn)行相關(guān)性分析，得到各成分的回歸系數(shù)。其中系數(shù)絕對(duì)值反應(yīng)菊花黃酮不同成分及量對(duì)抗氧化活性的大小，回歸系數(shù)絕對(duì)值越大，說(shuō)明相關(guān)性越大；回歸系數(shù)的符號(hào)反應(yīng)菊花黃酮不同成分與抗氧化活性相關(guān)性(正相關(guān)或負(fù)相關(guān))。擬合出菊花黃酮不同成分及量與抗氧化活性之間的回歸線方程為Y= 0.191XQuercetin+ 0.196 XRutin+ 0.215 XBaicalin- 0.070 XApigenin+ 0.272 XChlorogenic acid。由此方程可知，各成分對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)大小為綠原酸 > 黃芩苷 > 蘆丁 > 槲皮素 > 芹菜素。其中，綠原酸、黃芩苷、蘆丁、槲皮素與黃酮樣品的抗氧化活性呈正相關(guān)，芹菜素與抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)，且綠原酸對(duì)菊花黃酮化合物的抗氧化活性貢獻(xiàn)最大，這剛好與文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果一致[8]。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)從菊花中提取黃酮化合物，HPLC分析其黃酮組成，DPPH法測(cè)其抗氧化活性，并以PLS探究樣品黃酮組分與抗氧化活性間的相關(guān)性。結(jié)果表明各菊花黃酮化合物均具有一定的抗氧化活性，且各菊花黃酮化合物種類及含量存在一定的差異。黃酮化合物組成與抗氧化活性間的相關(guān)性研究表明綠原酸、黃芩苷、蘆丁、槲皮素與黃酮樣品對(duì)抗氧化活性呈正相關(guān)，芹菜素與抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)。