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        黃芩苷對Hela 細胞凋亡的影響

        2020-02-18 12:43:34蘇嘉文卜亞麗葉敦敏
        中成藥 2020年1期
        關鍵詞:卡鉑黃芩批號

        蘇嘉文,卜亞麗,李 瑄,葉敦敏*

        (1.廣州中醫(yī)藥大學,廣東 廣州 510405; 2.廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510375)

        宮頸癌是婦科最惡性腫瘤之一,近年來,隨著HPV感染的增加,35 歲以下年輕女性宮頸癌的發(fā)病率不斷上升,是許多女性癌癥死亡的主要原因之一[1]。目前治療宮頸癌的臨床方案容易導致不良反應或嚴重并發(fā)癥。此外,許多常用的抗癌化學治療劑對正常細胞具有細胞毒性作用。因此,迫切需要開發(fā)有效的,非細胞毒性的化學治療方法[2]。

        黃芩苷,一種從中草藥黃芩中提取的黃酮類化合物,具有抗氧化、抗增殖、抗菌、抗病毒等多種生物活性[3]。研究證實黃芩苷通過誘導細胞凋亡和抑制遷移來抑制各種癌細胞的增殖,具有體外和體內(nèi)廣泛的抗腫瘤活性[4]。雖然黃芩苷可以抑制多種癌細胞的生長,但是對正常細胞毒性較小,因此可能是治療癌癥的更好選擇[5]。早期研究表明,黃芩苷可誘導宮頸癌、人結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和伯基特淋巴瘤的細胞凋亡[6]。黃芩苷作為一種新的抗癌藥物和一種潛在的抗人類高級黏液表皮樣癌的化療藥物,具有很深遠的研究前景,但是黃芩苷對HeLa 細胞的作用及其潛在的分子機制尚不清楚。

        細胞凋亡在維持細胞增殖和細胞死亡之間的平衡中起重要作用。據(jù)報道,在許多人類腫瘤細胞中,如果細胞凋亡受到嚴重阻礙,細胞的增殖將不受限制,因此細胞增殖與細胞凋亡之間的平衡對于器官的發(fā)育和維持正常功能的發(fā)揮具有重要的作用[7]。在進一步的大規(guī)模研究中,已發(fā)現(xiàn)臨床應用最多的抗癌藥物是通過誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)揮抗癌作用,因此用于誘導細胞凋亡的藥物被認為對癌癥治療有效[8]。學者證實PI3K/AKT/mTOR 通路的過表達在CC發(fā)生、病程進展中起到了重要的促進作用,PI3K/AKT/mTOR 通路是癌細胞存活的首要通路,具有“抗細胞調(diào)亡途徑”之稱[9]。因此,本實驗以Hela 細胞為研究對象,觀察黃芩苷對其活力影響及誘導凋亡作用效果,并對黃芩苷抗宮頸癌機制進行了初步研究,有可能為宮頸癌治療提供新型有效的防治手段。

        1 材料

        1.1 試劑與藥物 RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(0.25%)、PBS(美國 GIBCO 公司,批號分別為C11875500BT、10099141、25200056、1GC1001);Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(中國聯(lián)科生物公司,批號70AP101100);Hoechst 33342 染色液(上海碧云天生物技術有限公司,批號C0017);蛋白提取試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,批號AR015730);ECL 化學發(fā)光增強試劑盒(廣州天駿生物科技有限公司,批號205001000);MTT,DMSO(美國Sigma 公司,批號分別為M5655、D4540);卡鉑(山東齊魯制藥有限公司,批號9110112ES);黃芩苷(北京索萊寶生物科技有限公司,批號S90016);β-actin、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 抗體[賽信通(上海)生物試劑有限公司,批號分別為4967S、4228、4060、5536]。

        1.2 儀器 HERAcell 150i/240i CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司);Epoch 全波長酶標儀(美國Bio-Tek 公司);OptiMair 垂直流超凈工作臺(新加坡藝思高科技有限公司);FC500 流式細胞儀(美國Beckman Coulter 公司);IX71+DP72 型倒置顯微成像系統(tǒng)(日本Olympus 公司);OG 小型垂直電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司);Image Quant LAS 4000 成像系統(tǒng)(美國GE Healthcare 公司)。

        2 方法

        2.1 Hela 細胞培養(yǎng) Hela 細胞由廣東省中醫(yī)院實驗中心提供,加入含有10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中生長,細胞每2~3 d 傳代1 次。

        2.2 藥物配制 黃芩苷溶解于DMSO 中配至母液濃度為1 mmol/L作為貯備液,并在4 ℃下保存,每次實驗前用RPMI1640 培養(yǎng)基稀釋至所需濃度,所有黃芩苷組的DMSO終濃度均小于0.1%;卡鉑溶解于雙蒸水,混勻,配置為1 mg/mL溶液,實驗前用RPMI1640 培養(yǎng)基稀釋至所需濃度,常溫保存。

        2.3 細胞分組 Hela 細胞分為空白組、卡鉑組及黃芩苷低、高劑量組。空白組與含10% 血清的培養(yǎng)基共同孵育24 h,卡鉑組按照文獻報道[10]加入40 μg/mL 卡鉑,培養(yǎng)24 h;黃芩苷低、高劑量組按照文獻報道[11]分別加入40、80 μmol/L,作用24 h。

        2.4 MTT 測定 MTT 法檢測黃芩苷對細胞活力的影響。將細胞以每孔5×103個濃度接種到96 孔板中,培養(yǎng)12 h 待細胞貼壁后,按照先前所述方法處理細胞。24 h 藥物作用結(jié)束后,向每個孔中加入20 μL MTT 溶液并在37 ℃下孵育4 h。然后除去MTT 溶液并向孔中加入150 μL DMSO,在搖床上搖晃10 min 后酶標儀測得吸光值(OD),計算細胞抑制率,公式為細胞抑制率=(1-OD實驗組/OD空白組)×100%。

        2.5 Hoechst 33342 染色 為了評估細胞及細胞核形態(tài),將Hela 細胞以每孔2×104個濃度接種于24 孔板,培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后,按照如前所述方法處理細胞。然后,在室溫下用4%多聚甲醛將細胞固定20 min,用Hoechst 33342染色10 min 后,觀察細胞并在熒光顯微鏡下拍照,選取340 nm 的激發(fā)波長和510 nm 的發(fā)射波長。Hela 細胞染色質(zhì)聚集,核固縮和凋亡小體出現(xiàn),被認為是凋亡細胞。各組細胞隨機挑選3 個視野進行凋亡細胞及總細胞計數(shù),實驗重復3 次。凋亡率=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

        2.6 Annexin V-FITF/PI 檢測 將Hela 細胞以每孔8×104個濃度接種在6 孔板,每孔1 mL,溫育12 h 后,按照如前所述方法處理細胞。然后收獲細胞,并用PBS 洗滌2 次,計數(shù)1×106個細胞并重懸于500 μL 結(jié)合緩沖液,每管加入5 μL Annexin V-FITC 或10 μL PI,輕柔渦旋混勻后,室溫避光孵育5 min。隨后使用流式細胞儀檢測Hela 細胞,獲得細胞凋亡率。

        2.7 Western blot 檢測 分析黃芩苷對PI3K/AKT/mTOR 通路的影響。將Hela 細胞以每孔1×105個細胞濃度接種于6孔板,培養(yǎng)12 h 待細胞貼壁后,按照如前所述方法處理細胞后,收集細胞。用冰冷的PBS 漂洗細胞,并在補充有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA 緩沖液中裂解30 min,將細胞裂解物離心10 min 后收集蛋白,并測定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白煮沸10 min 后,通過電泳在8%~12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中分離,之后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。5%BSA 封閉膜1 h 后,與 各種一抗(β-actin,1∶2 000;p-PI3K,1∶1 000;p-AKT,1∶2 000;p-mTOR,1∶1 000)4 ℃孵育過夜。隔日將聚偏二氟乙烯膜用PBS 沖洗后,在室溫下與二抗(1∶2 000)溫育1 h,化學發(fā)光增強試劑盒結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)使蛋白反應條帶可視化,使用Image J 軟件計算條帶的灰度值,公式為相對灰度值=實驗組灰度值/空白組灰度值。

        2.8 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 22.0 軟件進行分析,數(shù)據(jù)以(±s)表示。多組間差異使用單因素方差分析,LSD-t檢驗比較兩組間差異。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

        3 結(jié)果

        3.1 黃芩苷抑制Hela 細胞的增殖 與空白組比較,卡鉑組及黃芩苷低、高劑量組的細胞增殖受到抑制(P<0.01);與卡鉑組比較,黃芩苷低、高劑量組細胞增殖抑制率升高(P<0.01),提示不同濃度黃芩苷處理24 h 后,HeLa 細胞生長受到明顯抑制。見表1。

        表1 黃芩苷對Hela 細胞的增殖的影響(±s,n=6)

        表1 黃芩苷對Hela 細胞的增殖的影響(±s,n=6)

        注:與空白組比較,**P<0.01;與卡鉑組比較,△△P<0.01。

        3.2 黃芩苷誘導Hela 細胞凋亡 空白組的細胞呈圓形,大小相似,染色質(zhì)及細胞核染色均勻,較少出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮及核收縮的現(xiàn)象;卡鉑組及黃芩苷低、高劑量組的細胞出現(xiàn)了較多典型的凋亡特征,包括染色質(zhì)濃縮,核收縮和少數(shù)凋亡小體的形成,細胞凋亡高于空白組(P<0.01),而且隨著黃芩苷濃度的增加,Hela 細胞凋亡數(shù)量、核收縮、染色質(zhì)濃縮與凋亡小體亦隨之增多;黃芩苷(40、80 μmol/L)誘導細胞凋亡的效果優(yōu)于卡鉑(P<0.01)。見圖1。

        圖1 黃芩苷對Hela 細胞凋亡形態(tài)的影響(×200)

        經(jīng)流式細胞儀檢測,卡鉑及黃芩苷(40、80 μmol/L)處理24 h 后,凋亡率分別為(35±2.08)%、(53±1.45)%、(66±1.765)%,高于空白組(4±0.58)%(P<0.01),同時黃芩苷(40、80 μmol/L)凋亡率高于卡鉑(P<0.01)。見圖2。

        圖2 黃芩苷誘導Hela 細胞凋亡率的影響

        3.3 黃芩苷下調(diào)Hela 細胞PI3K/AKT/mTOR 通路的蛋白表達 與空白組比較,卡鉑組及黃芩苷低、高劑量組p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白表達降低(P<0.01),而且黃芩苷(40、80 μmol/L)抑制PI3K/AKT/mTOR 蛋白表達的效果優(yōu)于卡鉑(P<0.01)。見圖3。

        圖3 黃芩苷對PI3K/AKT/mTOR 通路的蛋白表達的影響

        4 討論

        宮頸癌是女性中第四大常見癌癥,也是全球第七大常見癌癥,全球有528 000 例新病例,據(jù)估計,2022 年宮頸癌死亡數(shù)為266 000 人,占所有女性癌癥死亡總數(shù)的7.5%[12]。宮頸癌主要治療方法是手術、放療、化療和免疫療法。但由于化療藥物的嚴重副作用,治療效果顯著降低,并出現(xiàn)了多種形式的耐藥性,因此,繼續(xù)尋找新的癌癥化學治療劑是必要的。

        近年來,由于中醫(yī)藥對腫瘤的有效治療效果,中醫(yī)藥引起了相當多的關注。在眾多草藥中,黃酮類化合物越來越被公認為是一種潛在的天然抗腫瘤藥物,對多類癌癥具有化學治療和化學預防的作用[13]。中藥天然藥劑具有許多優(yōu)點,與傳統(tǒng)化療藥物相比具有更低的有不良反應[14]。黃芩苷是天然中藥黃芩的有效成分,有大量證據(jù)表明黃芩苷在治療和預防各種類型癌癥中具有重要的作用[6]。最近的一項研究報道,黃芩苷通過激活Hela 細胞凋亡線粒體和死亡受體途徑,并上調(diào)Bax/Bcl-2 表達比例,促進Fas,F(xiàn)asL和caspase-8 的活化來抑制Hela 細胞的增殖[15]。另一項體內(nèi)研究顯示,在U14 宮頸癌小鼠中,黃芩苷通過上調(diào)Bax的表達,下調(diào)Bcl-2 的水平,從而起到抑制U14 宮頸癌細胞的腫瘤生長,誘導細胞凋亡的作用[4],體內(nèi)與體外研究表明黃芩苷可能是治療宮頸癌患者的藥物。本實驗首先使用MTT 法檢測黃芩苷對Hela 細胞活力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度黃芩苷處理24 h 后,Hela 細胞生長受到明顯抑制,細胞抑制率隨著黃芩苷濃度的升高而升高,呈劑量依賴性,且抑制細胞生長的效果由于傳統(tǒng)化療藥物卡鉑。

        細胞凋亡是一個活躍的過程,細胞凋亡是由半胱天冬酶和Bcl-2 家族蛋白質(zhì)執(zhí)行的程序化和規(guī)范的一種細胞死亡的形式,凋亡細胞經(jīng)歷染色質(zhì)凝聚和片段化,隨后形成含有完整細胞質(zhì),細胞器或細胞核碎片的凋亡小體。細胞凋亡失調(diào)發(fā)生在各種癌細胞中,這使得腫瘤細胞難以被殺傷,因此激活凋亡途徑或抑制抗凋亡途徑的藥物具有有效的潛力去治療癌癥[11]。本實驗采用hoechst 33342 染色和流式細胞術研究黃芩苷對Hela 細胞的凋亡形態(tài)及凋亡率的影響。結(jié)果表明黃芩苷使Hela 細胞凋亡數(shù)量,核收縮和染色質(zhì)濃縮與凋亡小體增多,細胞凋亡數(shù)量及細胞損傷程度呈劑量依賴性升高。另外,流式結(jié)果說明黃芩苷使Hela 細胞凋亡率呈劑量依賴性升高,說明黃芩苷誘導了Hela 細胞的早期凋亡,且黃芩苷誘導凋亡的效果優(yōu)于卡鉑。

        PI3K/AKT/mTOR 信號通路作為細胞內(nèi)重要信號傳導通路之一,與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。PI3K 涉及調(diào)節(jié)細胞生長或細胞凋亡的信號傳導途徑,監(jiān)管細胞生長或細胞凋亡途徑的PI3K 因子經(jīng)常在腫瘤中失調(diào),因此調(diào)節(jié)PI3K 成為治療腫瘤的有吸引力的靶點[16]。AKT 活性受PI3K 調(diào)節(jié),PI3K 將AKT 募集到細胞膜上,AKT 被各種生理因素刺激磷酸化而活化后,可誘導許多與細胞代謝、凋亡、增殖和分化有關的蛋白活化,進而能抑制細胞的凋亡并促進腫瘤的生長,且研究證實PI3K 和AKT 的激活發(fā)生在卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌和胰腺癌中[17-19]。研究表明抑制PI3K/AKT 通路可抑制細胞生長,并增加常規(guī)化療藥物在許多實體腫瘤中的細胞毒作用[20]。此外,mTOR 是PI3K/AKT 通路的主要下游靶點,mTOR 是腫瘤生長和細胞增殖,蛋白質(zhì)合成以及各種信號通路中信號調(diào)節(jié)的必需調(diào)節(jié)因子[21]。基于這些發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT/mTOR 通路被認為是治療癌癥的有希望的治療靶標。黃芩苷可以下調(diào)Hela 細胞PI3K/AKT/mTOR 通路的蛋白表達,從而抑制細胞的增殖,并誘導Hela 細胞的早期凋亡,且抑制PI3K/AKT/mTOR 通路的效果優(yōu)于卡鉑。

        總而言之,本實驗說明黃芩苷可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR 通路從而抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡,造成對Hela 細胞的毒性作用,在未來的研究中應該完善體外實驗,并探索黃芩苷在宮頸癌治療中的進一步機制。

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