宋 潔 劉曉紅

（遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧丹東118003）

北蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）又稱蛹蟲(chóng)草，屬子囊菌亞門(mén)、核菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬[1]。隨著北蟲(chóng)草市場(chǎng)需求不斷上升，采收北蟲(chóng)草子實(shí)體后廢棄培養(yǎng)基質(zhì)會(huì)越來(lái)越多，其中以小麥培養(yǎng)基質(zhì)居多。開(kāi)發(fā)利用北蟲(chóng)草廢棄基質(zhì)小麥資源，可以大幅度降低生產(chǎn)成本，并具有一定市場(chǎng)潛力。蟲(chóng)草素是北蟲(chóng)草中重要生物活性物質(zhì)之一，具有調(diào)節(jié)免疫力[2]、抑菌[3]、抗腫瘤[4-5]等作用。研究表明北蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基中含有蟲(chóng)草素[6]。響應(yīng)面分析法（responsesurface methodology，RSM）是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，可以確定試驗(yàn)考察因素及其之間交互作用在工藝過(guò)程中對(duì)響應(yīng)值的影響，精確表述考察因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系[7，8]。試驗(yàn)將響應(yīng)面分析方法應(yīng)用于北蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)殘基蟲(chóng)草素超聲提取工藝優(yōu)化，探究響應(yīng)值（多糖得率）與考察因素之間的數(shù)量關(guān)系，獲得最優(yōu)超聲提取工藝并予以驗(yàn)證，為北蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)殘基開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

北蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)殘基，由遼東生物產(chǎn)業(yè)研究所提供。樣品于50℃烘干打粉，60目過(guò)篩備用。蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所），甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

日本島津LC-10Avp高效液相色譜儀，SIL-10AVP自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-10Avp紫外檢測(cè)器，SCL-10Avp數(shù)據(jù)處理工作站，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 北蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)殘基中蟲(chóng)草素的提取及測(cè)定

準(zhǔn)確稱量北蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)殘基60目干粉5 g，加入適量甲醇超聲提取、離心，取上清100 μL加入超純水定容至1 mL，靜置，得到待測(cè)液。

HPLC測(cè)定蟲(chóng)草素含量：色譜柱Symmetry C18（5 μm，4.6 mm×150 mm），流動(dòng)相（甲醇∶水=15∶85），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，進(jìn)樣量10 μL，溫度25℃。

北蟲(chóng)草殘基中蟲(chóng)草素提取率的計(jì)算公式為：

式中：M1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的被測(cè)液中蟲(chóng)草素的含量（μg），M2為稱取的殘基粉末的質(zhì)量（g），V1為待測(cè)液分取的體積（mL），V2為待測(cè)液的總體積（mL）[9]，Y為北蟲(chóng)草殘基中蟲(chóng)草素提取率。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

超聲時(shí)間水平確定：固定超聲提取溫度60℃、提取次數(shù)3次、液（mL）料（g）比20、超聲功率100 W，超聲時(shí)間分別為 15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min。

超聲溫度水平確定：固定超聲時(shí)間15 min、提取次數(shù)3次、液（mL）料（g）比20、超聲功率100 W，超聲提取溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。

提取次數(shù)水平確定：固定超聲時(shí)間15 min、超聲溫度60℃、液（mL）料（g）比20、超聲功率100 W，提取次數(shù)分別為1次、2次、3次、4次、5次、6次。

液料比例水平確定：固定超聲時(shí)間15 min、超聲溫度60℃、提取次數(shù)3次、超聲功率100 W，液（mL）料（g）比分別為10、20、30、40、50、60。

超聲功率水平確定：固定超聲時(shí)間15 min、超聲溫度60℃、提取次數(shù)3次、液（mL）料（g）比20，超聲功率分別為40 W、60 W、80 W、100 W、120 W、140 W。

分析上述不同條件下，對(duì)北蟲(chóng)草小麥殘基中蟲(chóng)草素提取率的影響。按照1.2.1方法獲得蟲(chóng)草素提取率。

1.2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert.V8.0.6軟件中Plackett-Burman設(shè)計(jì)，進(jìn)行5因素2水平的一階試驗(yàn)，篩選出對(duì)蟲(chóng)草素提取率具有顯著影響作用的因素。

1.2.4 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出影響蟲(chóng)草素提取率的顯著因素，采用Design-Expert.V8.0.6軟件，通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行3水平的二階優(yōu)化，獲得最優(yōu)超聲提取北蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)殘基中蟲(chóng)草素的工藝方法，并進(jìn)行模擬驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)單因素對(duì)小麥培養(yǎng)殘基蟲(chóng)草素提取率的影響

通過(guò)HPLC檢測(cè)超聲提取蟲(chóng)草素在不同超聲時(shí)間、不同超聲溫度、不同提取次數(shù)、不同液料比、不同超聲功率條件下，所積峰面積，利用公式計(jì)算出不同條件下，北蟲(chóng)草殘基中蟲(chóng)草素提取率見(jiàn)圖1（a、b、c、d、e）。

蟲(chóng)草素提取率隨著超聲提取時(shí)間延長(zhǎng)而提高，當(dāng)超聲提取時(shí)間在45 min時(shí)最佳，時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)蟲(chóng)草素提取影響不大（圖1a）；超聲提取溫度過(guò)高會(huì)破壞蟲(chóng)草素分子結(jié)構(gòu)，60℃蟲(chóng)草素提取率最高，超過(guò)60℃后提取率降低（圖1b）；提取次數(shù)大于3次，蟲(chóng)草素提取率基本沒(méi)變（圖1c）；提取料液比對(duì)蟲(chóng)草素提取率影響較大，相同北蟲(chóng)草培養(yǎng)殘基，液（mL）料（g）比在30時(shí)，提取率最優(yōu)（圖1 d）。超聲功率大于60 W對(duì)蟲(chóng)草素提取率影響不大，120 W蟲(chóng)草素提取率最高（圖1e）。

圖1 北蟲(chóng)草殘基中蟲(chóng)草素提取率單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果與分析

單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)（N=12）篩選對(duì)蟲(chóng)草素提取率顯著影響因子，并輸入因子超聲時(shí)間（X1）、超聲溫度（X2）、提取次數(shù)（X4）、提取液料比（X5）、超聲功率（X6），X3、X7為虛擬因子，每項(xiàng)均取高（+1）低水平（-1），響應(yīng)值Y為蟲(chóng)草素提取率（%），具體見(jiàn)表1和表2。

利用Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析。由表3中可以看出，模型具有極顯著性，該模型可以用于北蟲(chóng)草小麥殘基中蟲(chóng)草素提取率顯著性影響因素分析=0.9874與R2=0.9770接近，該模型具有較好的解釋力，精密度28.651＞4，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)可信度和精確度較好，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響可由P值看出，提取液料比（X5）對(duì)蟲(chóng)草素提取率影響極顯著，超聲時(shí)間（X1），超聲溫度（X2）對(duì)蟲(chóng)草素提取率影響顯著，故選擇此3個(gè)因素為響應(yīng)面法試驗(yàn)因素。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平

表2 N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治?/p>

2.3 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析

結(jié)合單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman結(jié)果，利用響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，固定提取次數(shù)（3次），超聲功率（120 W），選擇超聲時(shí)間（X1）、超聲溫度（X2），提取液料比（X5）為自變量，蟲(chóng)草素提取率（Y）為因變量，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表4，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)因素水平

表5 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸方差擬合，獲得回歸方程為：Y=0.067+0.016×X1+6.013×10～3X2+0.029X5-5.975×10-3X1X2-2.883×10-3X1X5+1.100×10-3XX-7.326×10-3-3.159×10-3+4.899×10-3根據(jù)回歸方程模型方差分析顯示：模型P值極顯著，失擬項(xiàng)P值0.0625＞0.05不顯著，蟲(chóng)草素提取率（Y）與回歸方程關(guān)系好，誤差較小，相關(guān)系數(shù)R2=0.9948，模型擬合程度好，R2Adj=0.9882與R2接近，有較好的解釋力，可以解釋98.82%的響應(yīng)值變化，該模型可用于北蟲(chóng)草小麥殘基中蟲(chóng)草素提取率分析與預(yù)測(cè)，具體見(jiàn)表6。

從響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治霰?中顯示回歸方程一次項(xiàng)X1、X2、X5、二次項(xiàng)X12、X52的P值均達(dá)到極顯著的水平，二次項(xiàng)X22的P值為顯著水平，說(shuō)明超聲時(shí)間、超聲溫度、提取液料比對(duì)蟲(chóng)草素提取率影響顯著。二次項(xiàng)X1X2的P值極顯著，表明超聲時(shí)間與超聲溫度的交互作用對(duì)蟲(chóng)草素提取率影響極顯著。從圖2的響應(yīng)面與等高線中可以看出，超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)蟲(chóng)草素提取率的影響均呈拋物線型，等高線斜率大，曲面較陡。當(dāng)固定提取液（mL）料（g）比為20，蟲(chóng)草素提取率隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)不斷升高后呈拋物線下降趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為45 min，蟲(chóng)草素提取率最大，超聲溫度提高到60℃，拋物線達(dá)到至高點(diǎn)，隨后蟲(chóng)草素提取率呈下降趨勢(shì)。

表6 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治?/p>

圖2 超聲時(shí)間和超聲溫度交互作用對(duì)蟲(chóng)草素提取率影響的曲面和等高線圖

根據(jù)表5試驗(yàn)結(jié)果得到回歸方程，進(jìn)一步分析獲得最優(yōu)提取工藝條件：當(dāng)超聲時(shí)間45 min，超聲溫度45℃，提取液（mL）料（g）比20時(shí)，蟲(chóng)草素提取率理論預(yù)測(cè)值為0.1037%，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中預(yù)測(cè)值95%可能性在0.0941%到0.1133%之間。

最優(yōu)提取工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)：對(duì)最優(yōu)工藝進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)取平均值為0.0994%，低于理論值，但在預(yù)測(cè)值范圍內(nèi)，說(shuō)明響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到超聲提取模型準(zhǔn)確可靠。具體見(jiàn)表7。

表7 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證

3 小結(jié)

采用超聲提取北蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)殘基中蟲(chóng)草素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出顯著性影響因素。通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化北蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)殘基中蟲(chóng)草素超聲提取工藝，結(jié)果表明：超聲提取北蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)殘基中蟲(chóng)草素最優(yōu)工藝條件為：超聲時(shí)間45 min，超聲溫度45℃，提 取 液（mL）料（g）比 20，蟲(chóng) 草 素 提 取 率 為0.0994%。