糜玲， 周波， 李永， 彭金剛， 湯磊， 黃家宇

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 藥物分析教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

干眼癥又稱(chēng)干燥性角膜結(jié)膜炎，是多種因素所致的一種淚液和眼表疾病，包括眼表不適癥狀、視力變化和淚膜不穩(wěn)定，并且伴有潛在的眼表?yè)p害，是眼科中發(fā)病率最高的眼表疾病之一[1-2]。目前干眼癥的治療多為人工淚液替代療法，臨床常用的人工淚液大多僅補(bǔ)充水液層，個(gè)別制劑中添加了脂質(zhì)成分以降低淚液蒸發(fā)，改善黏蛋白功能的人工淚液國(guó)內(nèi)尚無(wú)上市產(chǎn)品，目前國(guó)外進(jìn)入臨床研究的主要是P2Y2受體激動(dòng)劑(如地夸磷索四鈉滴眼液)和黏蛋白分泌激動(dòng)劑(包括瑞巴派特和吉法酯)2大類(lèi)[3-4]。吉法酯，商品名惠加強(qiáng)-G，是一種黏蛋白分泌激動(dòng)劑，臨床上用于胃黏膜保護(hù)劑，還可以在干眼癥中發(fā)揮治療作用[5-7]。市售吉法酯為4Z構(gòu)型吉法酯和4E構(gòu)型吉法酯2種異構(gòu)體的混合物[8]，但是哪一個(gè)構(gòu)型的吉法酯在干眼癥的治療作用中起主要作用尚不明確。因此，本研究通過(guò)建立干眼癥大鼠動(dòng)物模型，使用Shirmer I方法測(cè)量大鼠淚液分泌體積、角膜熒光素鈉染色評(píng)價(jià)角膜光滑度、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色法觀(guān)察角膜形態(tài)學(xué)及過(guò)碘酸雪夫氏(periodic acid-Schiff, PAS)染色法計(jì)數(shù)結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量，探討4Z、4E吉法酯及混合型吉法酯對(duì)干眼癥大鼠角膜的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物及分組 6周齡的雌性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。在各12 h明暗周期、溫度22 ℃、濕度40%～50%的飼養(yǎng)室飼養(yǎng)1周適應(yīng)后，隨機(jī)分為正常組、生理鹽水對(duì)照組、4Z吉法酯治療組(4Z組)、4E吉法酯治療組(4E組)和混合吉法酯治療組(混合組，4Z ∶4E=30 ∶70)，每組8只。

1.1.2藥物和試劑 4Z構(gòu)型和4E構(gòu)型吉法酯由貴州醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湯磊教授課題組制備(純度大于98%)，東莨菪堿氫溴酸鹽購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司(批號(hào)P1231580)，熒光素鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)46960-100G-F)，淚液檢查酚紅棉線(xiàn)購(gòu)自天津晶明新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司(批號(hào)20161201)，HE染色試劑盒(批號(hào)G1120)和PAS糖原染色試劑盒(批號(hào)G1281)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3儀器 SLM-2ER型眼科裂隙燈顯微鏡檢查儀購(gòu)自重慶康華瑞明科技股份有限公司，NIKON TS100型倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司，RM2235型石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1干眼癥動(dòng)物模型 除正常組外，其余各組大鼠皮下注射6 g/L東莨菪堿氫溴酸鹽，4次/d(9時(shí)、12時(shí)、15時(shí)和18時(shí))、0.5 mL/次，連續(xù)給藥28 d[9-10]；期間用風(fēng)扇增強(qiáng)室內(nèi)空氣對(duì)流，除濕機(jī)控制空氣相對(duì)濕度為30%～40%[11]。

1.2.2給藥方案 各治療組大鼠分別使用10 g/L相應(yīng)構(gòu)型吉法酯滴眼液治療 ，5次/d(9時(shí)、11時(shí)、13時(shí)、15時(shí)及17時(shí))、每只眼睛20 μL/次，連續(xù)治療14 d；正常組和生理鹽水組大鼠用同體積的生理鹽水于相同時(shí)間點(diǎn)滴眼。

1.2.3Shirmer I試驗(yàn) 于治療前、治療第7及14天腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，待角膜反射消失后，將酚紅棉線(xiàn)在距離外側(cè)角約1/3處的下穹窿中放置30 s后拔出，記錄棉線(xiàn)紅色部分長(zhǎng)度(mm)來(lái)代表大鼠淚液體積的分泌量[12]。

1.2.4角膜熒光素鈉染色評(píng)分 每次Shirmer I試驗(yàn)結(jié)束后，每只眼睛滴入0.01%熒光素鈉5 μL，3次人工眨眼后在裂隙燈下用鈷藍(lán)光觀(guān)察熒光素鈉著色情況并拍照。將眼表分為4個(gè)象限，每個(gè)象限根據(jù)染色情況評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是無(wú)染色為0分，分散、點(diǎn)狀染色為1分，成群點(diǎn)狀染色為2分，成片狀染色為3分；4個(gè)象限評(píng)分總和為該鼠的角膜染色評(píng)分[13-14]。

1.2.5HE染色 治療第14天時(shí)，麻醉后冰上處死大鼠，立即摘除左右眼球，置固定液保存于4 ℃；常規(guī)石蠟脫水，進(jìn)半苯半蠟前沿角鞏膜緣剪開(kāi)眼球并去除玻璃體，常規(guī)石蠟包埋，平行于眼軸作6 μm連續(xù)切片，烤片后石蠟切片脫蠟至水，放入蘇木精染料10 min后蒸餾水清洗3次，伊紅染料5 min后常規(guī)脫水封片，顯微鏡下觀(guān)察角膜組織形態(tài)并拍照。

1.2.6PAS染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟后蒸餾水浸泡10 min，按照PAS糖原染色試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟對(duì)切片進(jìn)行染色后，梯度酒精脫水，二甲苯透明后樹(shù)膠封片，每個(gè)切片在顯微鏡下取3個(gè)視野計(jì)數(shù)杯狀細(xì)胞、取平均，并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 淚液體積

治療前，各治療組大鼠與生理鹽水組之間淚液體積比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療第7天時(shí)，4E組和混合組大鼠的淚液體積大于生理鹽水和4Z組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；治療第14天時(shí)，各組大鼠的淚液體積均略有所升高，各治療組淚液體積明顯高于生理鹽水組大鼠(P<0.01)，但同期各治療組大鼠之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

注：與同期生理鹽水組比較，(1)P<0.01,(2)P<0.05；(3)與同期4Z組比較，P<0.01。圖1 各組大鼠淚液體積的比較Fig.1 Tear volume of rats in each group after treatment

2.2 角膜熒光素鈉染色評(píng)分

治療前，各治療組大鼠與生理鹽水組之間角膜熒光素納染色評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療第7天時(shí)，4E組大鼠角膜熒光素納染色評(píng)分低于與生理鹽水組(P<0.05)，其余治療組與生理鹽水組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療第14天，各治療組大鼠角膜熒光素納染色評(píng)分明顯低于生理鹽水組(P<0.01)，但各治療組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

注：與生理鹽水組相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖2 各組大鼠角膜熒光素鈉染色評(píng)分Fig.2 Difference of corneal fluorescein sodium staining score in each group of rats

2.3 HE染色

與正常組大鼠比較，生理鹽水組大鼠角膜上皮細(xì)胞略有增厚，各層細(xì)胞分層不明顯，細(xì)胞體積變大、排列不緊密、核間距較大，部分基底層細(xì)胞缺失出現(xiàn)空泡，且上表層細(xì)胞有脫落現(xiàn)象，越靠近角膜表面細(xì)胞逐漸變成鱗狀上皮細(xì)胞；與生理鹽水組大鼠相比，各治療組大鼠角膜的病理變化有一定程度減輕，即細(xì)胞排列變得緊密，核間距減小，鱗狀上皮細(xì)胞減少；4Z組大鼠的角膜表皮上層細(xì)胞變得光滑，基底層細(xì)胞還有部分空泡出現(xiàn)；4E組和混合組上層細(xì)胞細(xì)胞排列最為規(guī)則，且基底層排列緊密無(wú)空隙。見(jiàn)圖3。

注：A為正常組，B為生理鹽水組，C為4Z組，D為4E組，E為混合組。圖3 治療第14天時(shí)各組大鼠角膜形態(tài)學(xué)改變(HE，×200)Fig.3 Difference of HE staining in cornea of rats in each group(HE，×200)

2.4 PAS染色及杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)

PAS梁色結(jié)果顯示，杯狀細(xì)胞分布于結(jié)膜的上皮細(xì)胞層，染色后呈玫紅色(箭頭所指出)，可分泌黏蛋白潤(rùn)濕角膜和結(jié)膜、保護(hù)眼表，與正常組大鼠相比，生理鹽水組大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞明顯減少(見(jiàn)圖4)。杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，各治療組大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量分別高于生理鹽水組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；4E組和混合組大鼠杯狀細(xì)胞數(shù)量均高于4Z組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

注：A為正常組，B為生理鹽水組，C為4Z組，D為4E組，E為混合組；箭頭所示為杯狀細(xì)胞。圖4 治療第14天時(shí)各組大鼠PAS染色(200×)Fig.4 The difference of PAS staining among different groups of rats(200×)

注：與生理鹽水組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01；(3)與4Z組比較，P<0.05。圖5 治療第14天時(shí)各組大鼠杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.5 Goblet cell counts in each group of rats

3 討論

干眼癥是一種眼表自身免疫性疾病，目前尚無(wú)特效治療藥物，影響超過(guò)35%的人群，其核心病變是因淚液長(zhǎng)期質(zhì)或量的改變引起淚膜不穩(wěn)定而導(dǎo)致的眼表?yè)p傷[12]。淚膜是位于角膜前端的一層淚液薄膜，由具有潤(rùn)濕和清潔眼表作用的淚液組成，正常人眨眼時(shí)淚液就會(huì)均勻分布于眼表形成淚膜，任何原因引起淚膜的不穩(wěn)定均會(huì)引起眼表疾病[13]。干眼癥患者由于長(zhǎng)時(shí)間的淚液缺失會(huì)引起眼表一系列的變化，角膜熒光素鈉染色能直觀(guān)反映眼表?yè)p傷情況，HE染色可以觀(guān)察角膜上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。本次研究結(jié)果顯示，與正常組大鼠相比，造模組大鼠由于藥物和環(huán)境的影響，從第7天開(kāi)始淚液明顯減少，持續(xù)干擾第14天時(shí)能觀(guān)察到角膜熒光素鈉染色評(píng)分明顯升高，同時(shí)通過(guò)HE染色可觀(guān)察到角膜上皮細(xì)胞鱗狀化生，嚴(yán)重時(shí)可見(jiàn)上皮細(xì)胞脫落。眼表給予不同構(gòu)型吉法酯治療后，角膜熒光素鈉染色和HE染色結(jié)果都顯示吉法酯能明顯改善干眼癥大鼠的眼表?yè)p傷情況，且4E吉法酯優(yōu)于4Z吉法酯。這與淚液體積的結(jié)果相互印證，各構(gòu)型吉法酯對(duì)干眼癥大鼠都有保護(hù)作用，且4E構(gòu)型吉法酯治療后第7天療效明顯，4Z構(gòu)型吉法酯治療第14天時(shí)才能發(fā)揮比較好的治療效果。

黏蛋白是一類(lèi)大分子糖化蛋白分泌細(xì)胞，主要是參加角膜上皮細(xì)胞防御機(jī)制，固定淚膜水液層，防止淚液水分流失，使其形成凝膠，從而達(dá)到穩(wěn)定淚膜的作用[14]。已有研究顯示干眼癥患者通常伴隨著結(jié)膜杯狀細(xì)胞內(nèi)部總量和分布的變化，其缺失可以導(dǎo)致黏蛋白分泌減少，引起淚膜不穩(wěn)定[15]；眼表上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生膜結(jié)合型黏蛋白，與分泌性黏蛋白形成保護(hù)、潤(rùn)滑眼表的親水性屏障，有助于淚液的穩(wěn)定性以及保持淚膜的親水性[16-17]。黏蛋白主要就是由結(jié)膜杯狀細(xì)胞分泌，PAS染色結(jié)果顯示，2種吉法酯在治療第14天后都能增加干眼癥大鼠的結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量(P<0.05)，且4E治療組的杯狀細(xì)胞數(shù)量多于4Z治療組及混合治療組(P<0.05)，與4Z吉法酯和混合吉法酯相比，4E構(gòu)型吉法酯能更好地增強(qiáng)干眼癥大鼠淚膜穩(wěn)定性。這種構(gòu)型差異帶來(lái)的藥效差異可能是因?yàn)樗幬锓肿拥碾p鍵或剛性或半剛性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致分子內(nèi)自由旋轉(zhuǎn)受到限制而產(chǎn)生的，藥物結(jié)構(gòu)中的某些官能團(tuán)在空間排列上出現(xiàn)差異，幾何異構(gòu)體空間結(jié)構(gòu)上的差異均可影響藥物分子的理化性質(zhì)，導(dǎo)致藥物分子在生物體中吸收、分布和代謝產(chǎn)生差異、最終導(dǎo)致藥理藥效的不同 。

綜上所述，4Z、4E及混合式吉法酯都能對(duì)干眼癥大鼠在增加淚液體積、降低眼表?yè)p傷和增加結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量等方面有不同程度的保護(hù)，且4E構(gòu)型吉法酯在增加淚液體積和減少角膜熒光素鈉染色評(píng)分方面明顯優(yōu)于4Z構(gòu)型吉法酯，對(duì)吉法酯的使用具有指導(dǎo)意義。