王冰玉 ，蔡 穎 ，鄭 凱，謝紅衛(wèi)，徐新云

(1．深圳市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康所，廣東 深圳 518055；2．南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

細(xì)顆粒物(fine particulate matte，PM2.5)指空氣中空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑≤2.5μm的顆粒物[1-2]。因其易附帶有毒、有害物質(zhì)，且粒徑小，活性強(qiáng)，易較長(zhǎng)時(shí)間懸浮在空氣中，對(duì)大氣環(huán)境以及人體健康都產(chǎn)生較大的危害作用，尤其是對(duì)呼吸系統(tǒng)的威脅最為嚴(yán)重[3]。已有許多研究表明，PM2.5短期暴露后，可使局部支氣管的通氣功能下降；長(zhǎng)期暴露后，可發(fā)生支氣管炎、哮喘甚至肺癌[4]。隨著工業(yè)發(fā)展和經(jīng)濟(jì)水平快速提高，我國(guó)大氣中PM2.5濃度的增加，遠(yuǎn)高于世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦的空氣質(zhì)量水平[4]，導(dǎo)致空氣污染加劇，對(duì)人類健康造成了極大的威脅，因此，探討PM2.5的致病機(jī)制和預(yù)防控制措施十分重要。

基因芯片是20世紀(jì)80年代中期提出來(lái)的一種基于堿基雜交互補(bǔ)原理進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測(cè)等的技術(shù)，因其具備高通量、自動(dòng)化、高效等特點(diǎn)，越來(lái)越為廣大科研工作者所青睞，為進(jìn)一步探索疾病的發(fā)病機(jī)制及其臨床診斷和治療具有重要意義。基因芯片又稱DNA集微芯片、DNA微陣列技術(shù)，其主要原理是分子生物學(xué)中的核酸分子原位雜交技術(shù)，通過(guò)技術(shù)手段將DNA片段固定到介質(zhì)上，隨后將熒光標(biāo)記樣本與其雜交，從而對(duì)樣本基因進(jìn)行規(guī)模檢驗(yàn)[5]。江勇等發(fā)現(xiàn)基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Ontology，GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)功能分析可以發(fā)現(xiàn)肝癌潛在的發(fā)病機(jī)制和核心基因，為肝癌的診斷和治療提供了依據(jù)[6]。儲(chǔ)海燕等運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了染毒PM2.5后人支氣管上皮細(xì)胞全基因組的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)表達(dá)變化的基因中的一部分也可能導(dǎo)致了心腦血管疾病的發(fā)生[7]，將A549細(xì)胞暴露于PM2.5中已知的有機(jī)物成分中，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞的基因表達(dá)譜發(fā)生改變，并且通過(guò)GO分析發(fā)現(xiàn)這些發(fā)生改變的基因主要參與芳烴受體的激活、內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的代謝，從而影響細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、癌變及増殖過(guò)程[8]。基于上述研究，利用基因芯片技術(shù)對(duì)PM2.5毒性的研究是非常有意義的，為之后的鑒定和課題深入研究奠定基礎(chǔ)。人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells，HBE)是永生化人支氣管細(xì)胞系，仍保持人支氣管上皮細(xì)胞及非致瘤性特征，且PM2.5對(duì)人群的危害，首先波及上呼吸道，選用HBE細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)處理對(duì)象，可使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近人群真實(shí)情況。本文采用基因芯片技術(shù)，對(duì)PM2.5暴露的HBE細(xì)胞以及對(duì)照組進(jìn)行差異基因篩選[8]，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，進(jìn)一步對(duì)篩選得到的差異基因進(jìn)行聚類以及功能富集分析，篩選與PM2.5致癌致突變的核心基因以及構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，以探討PM2.5致HBE細(xì)胞基因表達(dá)水平的改變情況，為進(jìn)一步研究PM2.5對(duì)HBE的毒性作用機(jī)制提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HBE細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)上海細(xì)胞庫(kù)，PM2.5樣品來(lái)源山西省太原市，胎牛血清(FBS)、0.25%Trpsin-EDTA購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司，QIAGEN RNeasy?Mini Kit試劑盒購(gòu)于德國(guó)QIAGEN公司，氨基烯丙基擴(kuò)增試劑盒(Amino Allyl MessageAmp II aRNA Amplification Kit，AM1753)購(gòu)于美國(guó)Ambion公司。

1.2 PM2.5的采集和制備

實(shí)驗(yàn)用武漢天虹TH150 F中流量采樣器和80 mm直徑的石英濾膜，按100 L/min的流量連續(xù)采樣，每天采樣24 h，采樣地點(diǎn)在山西省太原市山西大學(xué)校園內(nèi)，采集時(shí)間為2018年12月。將吸附有PM2.5顆粒的石英濾膜剪成4小塊放入裝有超純水的燒杯中，用錫紙包住口，超聲振蕩30 min洗脫P(yáng)M2.5顆粒物，冷卻至室溫后放入-80℃冰箱。然后將樣品洗脫液真空冷凍干燥24 h后紫外線照射1 h，加入無(wú)菌水制備成PM2.5樣品儲(chǔ)備液，高壓滅菌后可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，使用前振蕩混勻。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒處理

用10%的胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基將HBE細(xì)胞培養(yǎng)于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積的70%～80%時(shí)，將培養(yǎng)的細(xì)胞消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)懸液濃度，然后以5×105個(gè)/mL的濃度接種至6孔板，每孔加2 mL DMEM完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿瓶底面積的80%左右時(shí)進(jìn)行PM2.5染毒處理，染毒濃度為50μg/mL，染毒時(shí)間24 h。

1.4 基因芯片

本研究使用的基因芯片由華大基因生物技術(shù)公司提供的人類基因體芯片(human OneArrayTM，HOA)，是以UniGene最新數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，應(yīng)用IMPORT專利技術(shù)進(jìn)行探針的開(kāi)發(fā)，設(shè)計(jì)高度專一化的60-mer寡核苷酸探針。每一芯片上布放超過(guò)3萬(wàn)個(gè)探針，涵蓋3萬(wàn)以上個(gè)基因及數(shù)種實(shí)驗(yàn)控制探針。

1.5 方法

1.5.1 樣本RNA提取和純化HBE細(xì)胞的總RNA使用QIAGEN RNeasy?Mini Kit試劑盒提取和純化細(xì)胞總RNA，通過(guò)NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific)進(jìn)行RNA濃度和純度的檢測(cè)，通過(guò)安捷倫RNA 6000 nano assay檢測(cè)RIN值來(lái)判斷RNA的完整性。

1.5.2 樣本制備質(zhì)控樣本制備包含RNA擴(kuò)增及熒光標(biāo)記。使用AM1753試劑盒擴(kuò)增得到氨基-烯丙基反義 RNA(Amino-allyl antisense RNA， aa-aRNA)， 與NHS-CyDye(Cy5)反應(yīng)結(jié)合完成熒光標(biāo)記與純化后進(jìn)行芯片雜交。本步驟質(zhì)控使用NanoDrop ND-1000對(duì)完成標(biāo)記的aa-aRNA定量，Cy5的標(biāo)記效率需達(dá)到每1 000個(gè)核苷酸包含15染料分子以上，同時(shí)采用D(260)/D(280)鑒定其純度。

1.5.3 芯片雜交與掃描芯片組合后，配制RNA混合物與變性物，用其將芯片雜交后將芯片清洗。將預(yù)熱于50℃烘箱中的芯片取出，于芯片第1層切口處加入加熱反應(yīng)完后的RNA mixture(180μL)。完成后套上第2層熱縮膜，放入50℃雜交烘箱旋轉(zhuǎn)架上，烘箱轉(zhuǎn)速設(shè)定約為2 r/min、反應(yīng)時(shí)間16 h。用預(yù)先準(zhǔn)備的42℃雜交清洗液I、II及25℃雜交清洗液II將芯片清洗，清洗后將芯片上的水分甩干后將芯片置于黑色芯片盒中，避光等待掃描。使用掃描儀Molecular Devices之AXON4000B掃描芯片。借由適當(dāng)?shù)臒晒鈴?qiáng)度設(shè)定與分辨率(10μm)獲得影像(tiff格式)。利用GenePixTM4進(jìn)行影像數(shù)據(jù)擷取，獲得初級(jí)數(shù)據(jù)格式gpr檔案即完成將影像轉(zhuǎn)成數(shù)值，進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.6 生物信息分析

1.6.1 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理和基因差異分析基因表達(dá)譜檢測(cè)芯片的數(shù)據(jù)分析是用 Rosetta Resolver?System(Rosetta Biosoftware)進(jìn)行數(shù)據(jù)前處理(含數(shù)據(jù)篩選、校正)與統(tǒng)計(jì)分析。利用基因表達(dá)倍數(shù)變化值(fold change，F(xiàn)C)篩選差異表達(dá)基因，篩選條件滿足log2|FC|≥1且P＜0.05；比對(duì)組別中至少一個(gè)樣本的探針訊號(hào)≥200，縮小FC的范圍，進(jìn)一步分析篩選出前10個(gè)上調(diào)基因和前10個(gè)下調(diào)基因。

1.6.2 GO功能注釋、通路及生物學(xué)功能富集分析使用Cluster Profiler軟件對(duì)篩選得到的差異基因在GO中注釋，并進(jìn)行通路及生物學(xué)功能富集注釋分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能和通路。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6.3 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖分析通過(guò)String軟件分析差異表達(dá)基因的蛋白互作關(guān)系，并以此來(lái)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互互作用網(wǎng)絡(luò)圖。將String蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析插件CytoHubba計(jì)算節(jié)點(diǎn)的邊(即互作連線的數(shù)量)，篩選得到網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)(hub node)。中心節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因即為核心蛋白。

2 結(jié)果

2.1 樣品RNA的總量與純度

本研究收集的樣品RNA總量與純度見(jiàn)表1，可見(jiàn)其符合實(shí)驗(yàn)要求。

表1 樣品RNA的總量與純度

2.2 基因的差異表達(dá)與聚類分析

根據(jù)差異表達(dá)篩選條件，在基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，PM2.5染毒處理HBE細(xì)胞后，共篩選出245個(gè)差異表達(dá)的基因，見(jiàn)表2。其中上調(diào)基因27個(gè)，下調(diào)基因218個(gè)，差異表達(dá)基因火山圖見(jiàn)圖1A。log2|FC|＜-1的為下調(diào)基因所在范圍，log2|FC|＞1為上調(diào)基因所在范圍，進(jìn)一步縮小篩選范圍篩選出排名前10的上調(diào)基因和下調(diào)基因?yàn)楹诵幕颉Ｍㄟ^(guò)聚類分析可視化重復(fù)及樣本間的相似性做出熱圖(圖1B)。本分析中以差異表達(dá)基因探針在所有芯片間的差異基因，篩選出前250基因探針進(jìn)入分析。

2.3 差異表達(dá)基因的GO功能注釋和富集分析

將篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和富集分析，結(jié)果表明，差異表達(dá)基因在分子功能(mlecular function，MF)、生物過(guò)程(biologicalprocess，BP)及細(xì)胞組成(cellular component，CC)的分布是存在差異的。分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要由細(xì)胞膜的固有成分、胞膜、細(xì)胞外圍等成分組成，富集在跨膜受體活性、受體活性、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分子傳導(dǎo)等分子功能。同時(shí)富集于離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞對(duì)脂多糖無(wú)機(jī)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過(guò)程，見(jiàn)圖2。

表2 PM 2.5染毒后核心基因表達(dá)

圖1 PM2.5染毒HBE細(xì)胞后的基因差異表達(dá)火山圖和聚類分析熱圖

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

KEGG富集分析結(jié)果顯示有7個(gè)最顯著的富集通路，核心富集通路表見(jiàn)表3，其主要涉及腫瘤細(xì)胞遷移、信號(hào)傳導(dǎo)、膽汁代謝相關(guān)、遺傳毒性等方面。排名前7的生物途徑富集分析見(jiàn)圖3，包括富集程度排名第1、與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤發(fā)生和遷移相關(guān)的focal adhesion通路，富集程度排名第2的與膽汁代謝相關(guān)的bile secretion通路，與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的ABC transporters通路等。

圖2 差異表達(dá)基因的GO功能注釋和富集分析圖

表3 核心富集通路表

圖3 排名前7的生物途徑富集分析

2.5 蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)分析

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

使用String蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)分析處理差異基因，構(gòu)建蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖4)，根據(jù)Cytoscape軟件篩選節(jié)點(diǎn)數(shù)最相關(guān)的5個(gè)核心蛋白，對(duì)應(yīng)的基因分別為生長(zhǎng)抑素基因SST、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因BDNF、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1基因NCAM1、生長(zhǎng)抑素受體1基因SSTR1和凋亡基因BCL2類11基因Bcl2L11。

3 討論

在我國(guó)許多城市，大氣PM2.5水平嚴(yán)重超岀WHO的標(biāo)準(zhǔn)。PM2.5空氣污染持續(xù)影響人群的公共健康，在可改變的危險(xiǎn)因素中，空氣污染位列造成我國(guó)疾病負(fù)擔(dān)的第4位[9]，中國(guó)排名前4位的死因分別是腦卒中(23.92%)，肺部疾病(14.28%)，冠心病(11.71%)以及肺腫瘤(5.19%)，這4種疾病均與PM2.5相關(guān)。而本文應(yīng)用基因芯片檢測(cè)PM2.5對(duì)HBE細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，從而為探究PM2.5致癌機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

本研究用PM2.5急性染毒HBE細(xì)胞24 h，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)深入分析其基因芯片的結(jié)果。根據(jù)篩選條件結(jié)果顯示上調(diào)基因27個(gè)，下調(diào)基因218個(gè)。這些結(jié)果提示PM2.5影響HBE細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程。通過(guò)對(duì)差異基因的GO功能注解聚集分析和KEGG生物途徑富集分析，結(jié)果顯示差異基因表達(dá)主要富集于細(xì)胞分子傳導(dǎo)等分子功能，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在跨膜受體活性、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等分子功能。同時(shí)富集于離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過(guò)程。KEGG富集分析顯示，HBE細(xì)胞中差異表達(dá)的基因涉及通路有與腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)的黏著力，與膽汁代謝相關(guān)的膽汁分泌，與神經(jīng)毒性、遺傳毒性相關(guān)的神經(jīng)活性配體-受體相互作用，參與細(xì)胞分化、免疫、凋亡的信號(hào)通路JAK-ATAT，這些為PM2.5致細(xì)胞凋亡和致癌作用機(jī)制提供了參考。

抑癌基因的正常功能是抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，其表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致功能的缺失有助于腫瘤的發(fā)生，WAP-4-二硫核結(jié)構(gòu)域蛋白(WAP four-disulfide core domain 1，WFDC1)基因定位于人染色體16q24.1上，最初被認(rèn)為是一種抑癌基因[10]，有研究表明，在肺、肝、膀胱和卵巢腫瘤中可以觀察到WFDC1基因的表達(dá)下調(diào)[11-13]，本文篩選出明顯差異低表達(dá)的WFDC1基因，可推測(cè)PM2.5染毒使抑癌基因WFDC1的表達(dá)異常下調(diào)，從而使其功能的缺失。Wnt信號(hào)通路與細(xì)胞的發(fā)育分化密切相關(guān)，對(duì)正常和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)都至關(guān)重要，因其啟動(dòng)蛋白為Wnt蛋白而得名[14]。研究表明SFRPs是分泌型蛋白，能結(jié)合Wnt，干涉Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)，其或與受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Wnt蛋白，或直接與Wnt蛋白結(jié)合，阻斷Wnt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled related protein 1，SFRP1)基因的差異高表達(dá)，提示PM2.5染毒HBE細(xì)胞后Wnt通路被激活，從而導(dǎo)致Wnt通路拮抗劑基因SFRP1的高表達(dá)。此外，本次研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5處理后，排名前10的表達(dá)上調(diào)的基因中，磷酸酶肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)因子1(phosphatase and actin regulator 1，PHACTR1)基因是排位第1，上調(diào)最明顯的基因；有研究表明此基因與小鼠急性肺損傷有關(guān)[16]，且此基因是肺癌DNA修復(fù)能力的決定性因素之一[17]，PHACTR1基因的高表達(dá)提示，PM2.5對(duì)HBE細(xì)胞的DNA損傷有一定影響，DNA損傷通常被認(rèn)為是引起細(xì)胞癌變或突變的重要原因。本課題組計(jì)劃在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，將重點(diǎn)針對(duì)與致癌相關(guān)的WFDC1、SFRP1基因，與DNA損傷相關(guān)的PHACTR1基因，進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因與PM2.5致癌致突變作用的分子機(jī)制。

綜上所述，PM2.5染毒HBE細(xì)胞后，其基因表達(dá)譜發(fā)生多方面的變化，涉及許多生物過(guò)程和通路的改變。本課題重點(diǎn)關(guān)注PM2.5致癌致突變作用，本文篩選出來(lái)的與PM2.5致癌致突變的差異基因及其相關(guān)蛋白和通路，為進(jìn)一步深入研究PM2.5毒性作用機(jī)制提供了非常有價(jià)值的信息和新的研究方向。