封 敏，艾比拜·莫合塔爾，石靜怡，祖可來·艾力江，李永祥，閆長順，李秀梅

(1．新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830011；2．新疆醫(yī)科大學臨床醫(yī)學專業(yè)，新疆 烏魯木齊 830011；3．新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830011)

2012年全球腫瘤統(tǒng)計數(shù)據(jù)(GLOBOCAN 2012)顯示食管癌(esophageal cancer，EC)是目前世界上常見惡性腫瘤之一，其死亡率位居所有癌癥原因死亡率的第6位，5年生存率僅為15%～25%[1]。食管癌的患病率因地區(qū)變化而顯著不同，在新疆，哈薩克族居民食管癌發(fā)病率(155.9/10萬)明顯高于其他少數(shù)民族[2]。小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類具有組織特異性或發(fā)育階段特異性表達特征的非編碼調(diào)控的小RNA，在動植物基因組中，已發(fā)現(xiàn)存在大量簇生排列的MIR基因，常位于一個多順反子內(nèi)，稱為MIR基因簇，其通過共表達影響胚胎生長發(fā)育、細胞周期和細胞分化等諸多方面，MIR143/145基因簇同位于染色體5q32位點上，是目前發(fā)現(xiàn)的一對具有重要生物學功能的MIR基因簇[3]。

Survivin是目前發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，其表達上調(diào)在眾多腫瘤發(fā)生中是一個早期事件，高表達Survivin的抗凋亡、促增殖作用在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。而miR-143、miR-145是我們前期采用microRNA芯片篩查出的在食管癌組織和癌旁組織中差異表達的microRNA，靶基因預測軟件顯示Survivin是miR-143的靶基因，但三者之間的關系在惡性腫瘤中研究較少，在哈薩克族食管癌中的研究未見報道，故本文采用熒光定量PCR方法檢測47例新疆哈薩克族食管癌組織及癌旁組織中miR-143、miR-145和Survivin mRNA的表達情況，分析其與哈薩克族食管癌臨床生物學行為的關系，對進一步了解哈薩克族食管癌發(fā)病機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

47例新疆哈薩克族食管癌組織及癌旁組織組織均取自2016—2018年新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院手術切除標本，患者術前均未接受放化療，手術中取材后迅速將標本置于液氮中，并于-80℃冰箱中貯存。病理切片均診斷為鱗狀上皮細胞癌，男性30例，女性17例。腫瘤按國際TNM分期(UICC，2009年)，Ⅰ期2例，Ⅱ期17例，Ⅲ期29例；有淋巴結轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結轉(zhuǎn)移17例；低分化28例，中高分化19例。

1.2 試劑和引物

miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、RT-PCR引物，均購于北京天根公司；RNA提取試劑Trizol購于Promega公司。引物序列如下：miR-143， 上 游 5′-GAGCTACAGTGCTTC-3′， miR-145，上游 5′-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3′，U6，上游 CTCGCTTCGGCAGCACA；Survivin，上游5′-TCTGGAGGTCATCTCGGCTGTTC-3′，下游 5′-TC CTCACTGCGGCTGTCTGG-3′；GAPDH，上游 5′-TC TGGAGGTCATCTCGGCTGTTC-3′，下 游 5′-TCCTCA CTGCGGCTGTCTGG-3′。

1.3 組織總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

采用Trizol試劑一步法提取總RNA，紫外分光光度計測定其純度。以提取的RNA為模板，按miScript II RT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。以得到的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增反應體積為20 μL，反應條件：94℃、2 min；94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40個循環(huán)；72℃、5 min，擴增反應結束后進行。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCT法進行分析，SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示；miR-143、miR-145、Survivin mRNA在哈薩克族食管癌組織和癌旁組織中表達水平的比較采用t檢驗；miR-143、miR-145、Survivin mRNA與哈薩克族食管癌臨床病理指標關系的分析采用t檢驗，Spearsman雙變量相關性分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 腫瘤組織中miR-143、miR-145、Survivin mRNA的表達

47例哈薩克族食管癌組織及癌旁組織中熒光定量PCR檢測結果見圖1，顯示與癌旁組織比較，腫瘤組織中miR-143、miR-145的相對表達水平均明顯下調(diào)，腫瘤組織中miR-143相對表達水平(0.31±0.08)約為癌旁組織的1/3，miR-145的相對表達水平(0.43±0.18)約為癌旁組織的1/2。與癌旁組織比較，腫瘤組織中Survivin mRNA的相對表達水平(3.67±0.56)升高(P＜0.01)。

圖1 哈薩克族食管癌組織及癌旁組織中miR-143、miR-145、Survivin mRNA的相對表達水平

2.2 哈薩克族食管癌組織中miR-143、miR-145、Survivin mRNA表達與臨床病理指標的關系

低分化、淋巴結轉(zhuǎn)移的食管癌組織及Ⅱb～Ⅲ期的腫瘤組織中miR-143相對表達水平分別低于高分化、淋巴結未轉(zhuǎn)移及Ⅰ～Ⅱa期的腫瘤組織；而miR-145在低分化及淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中的表達分別低于高分化及淋巴結未轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，差異均有統(tǒng)計學意義；淋巴結轉(zhuǎn)移及Ⅱb～Ⅲ期的腫瘤組織中Survivin mRNA的表達分別高于淋巴結未轉(zhuǎn)移及Ⅰ～Ⅱa期的腫瘤組織，差異均有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 食管癌組織中miR-143、miR-145、Survivin mRNA的表達與臨床病理指標的關系

2.3 miR-143、miR-145、Survivin mRNA相關性分析

Spearman相關分析顯示在哈薩克族食管癌組織中miR-143與miR-145的表達呈正相關(r=0.662，P=0.000)，miR-143與Survivin mRNA的表達負相關(r=-0.313，P=0.002)。

3 討論

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在我國食管癌的發(fā)病率具有明顯的地域性和民族特異性，在新疆，哈薩克族食管癌發(fā)病率最高，目前早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高食管癌患者五年生存率的有效方法，因此，尋找食管癌早期診斷和預后標志物有重要意義。MIR基因簇通常定位于染色體的特殊區(qū)域，是MIR家族中的各成員緊密成簇排列成大串的重復單位，同屬于同一個祖先的基因擴增產(chǎn)物。MIR143/145是目前公認的一對基因簇，在結構上均不編碼蛋白，不含開放閱讀框，同位于人類的第5號染色體，具體位置分別在5：148808481-148808586 和 5： 148810209-148810296，在功能上發(fā)揮類似的作用[4]。研究顯示在食管鱗狀細胞癌、肝癌等消化道腫瘤中miR-143和miR-145表達下調(diào)，且與細胞分化、腫瘤侵襲深度相關，體外劃痕實驗也證實，上調(diào)miR-143和miR-145表達可以顯著抑制食管癌細胞的遷移及細胞增殖，在食管癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌作用[5-6]。而新疆哈薩克族食管癌組織中miR-143和miR-145的表達未見文獻報道，故本實驗聯(lián)合檢測了47哈薩克食管癌組織及癌旁組織中miR-143和miR-145的表達，實驗結果顯示，哈薩克族食管癌組織中的miR-143和miR-145表達水平顯著低于遠端無癌組織，其中miR-143表達水平下調(diào)更明顯，僅為癌旁組織水平1/3，miR-143和miR-145表達正相關，病理因素分析顯示在低分化及淋巴轉(zhuǎn)移的哈薩克族食管癌組織中miR-143和miR-145表達顯著低于高分化及淋巴未轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，另外miR-143低表達還與臨床分期相關，隨著臨床病程的進展，miR-143呈現(xiàn)持續(xù)低表達，本次實驗結果提示在哈薩克族食管癌發(fā)生發(fā)展中miR-143和miR-145共同低表達，在哈薩克族食管癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮協(xié)同效應，且MIR143/145基因簇的低表達更有利于食管癌細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。目前大量研究顯示miR-143和miR-145在肺癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤中呈低表達[7]，通過抑制下游靶基因的表達調(diào)節(jié)細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、血管生成及腫瘤藥物的敏感性[8-13]，47例哈薩克族食管癌組織中miR-143和miR-145表達下調(diào)，結果與我們前期MIR基因芯片結果相一致，同時也與文獻報道的結果基本相符，但在哈薩克族食管癌中MIR143/145基因簇的協(xié)同作用機制尚需進一步研究。

Survivin是人類凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein family，IAP)家族中的分子量最小、凋亡抑制作用最強的凋亡抑制因子之一，也是我們前期在大量哈薩克族食管癌組織標本中篩查出顯著差異表達的基因[14-15]，在哈薩克族食管癌組織中表達明顯上調(diào)，且與淋巴結轉(zhuǎn)移、臨床分期的相關，Survivin高表達可以直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性從而抑制細胞凋亡，其次還可以間接地與細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4形成復合物，釋放出p21/CDK4復合體中的p21，從而直接抑制Caspase-3前體的激活，致使凋亡小體不能形成，阻斷細胞的凋亡過程[16-17]。曾劍等[18]實驗也證實Survivin表達陽性的食管癌更易發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移，惡性程度更高，本實驗結果與其基本一致，提示在新疆哈薩克族食管癌的發(fā)展中Survivin高表達參與了食管癌的進展及侵襲轉(zhuǎn)移的過程，可以作為評估食管癌惡性程度及轉(zhuǎn)移的生物學指標。

MIR生物學信息學靶標預測軟件(包括PicTar、miRanda和TargetScan)高度提示Survivin是MIR143/145基因簇的靶基因，故本實驗采用Spearman相關性分析顯示在47例哈薩克族食管癌組織標本中miR143低表達、Survivin mRNA高表達呈負相關，但miR-145的表達水平與Survivin mRNA的表達無明顯相關，我們推測在哈薩克族食管組織中miR-143和miR-145表達下調(diào)，作為一對基因簇發(fā)揮協(xié)同作用，低表達的miR143直接或間接導致Survivin mRNA高表達，從而促進食管癌細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，但在此過程中MIR143/145基因簇發(fā)揮協(xié)同效應中誰占主導地位，其與Survivin之間具體的調(diào)控機制未見相關文獻報道，我們將在后續(xù)的體外細胞試驗中進一步研究。

食管癌的發(fā)生是一系列內(nèi)外因素共同發(fā)揮效應的綜合結果，多種microRNA和多種基因在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，而新疆哈薩克族食管癌高發(fā)，且預后差，五年生存率低，故尋求特異性高、靈敏的分子標志物作為食管癌的早期診斷指標具有重要意義。MIR143/145基因簇低表達與Survivin高表達共同發(fā)揮作用參與了哈薩克族食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程，系統(tǒng)研究三者之間的關系有助于揭示在腫瘤發(fā)生發(fā)展中miRNA基因簇在腫瘤網(wǎng)絡調(diào)控中的作用。