朱夢夢 張澤家 趙 琳 范瑞瑞 葛少欽,

1 河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北省保定市 071002； 2 河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院

隨著人們生活水平、飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖顯然已經(jīng)成為全世界共同面臨的公共衛(wèi)生問題[1]。肥胖癥在臨床上根據(jù)病因可分為單純性和繼發(fā)性肥胖，單純性肥胖是指沒有明顯神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)形態(tài)及功能改變，但伴有脂質(zhì)、糖代謝調(diào)整過程障礙，是臨床中為主導(dǎo)的肥胖類型[2]。為了更好地研究肥胖的病理機(jī)制,為治療提供基礎(chǔ)依據(jù)，本研究用高脂飲食喂養(yǎng)建立單純性肥胖小鼠模型，通過其Lee’s指數(shù)、肝功能酶、血糖血脂的變化以及脂肪體積及分布情況等驗(yàn)證模型的可重復(fù)性，為進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼料 3周齡的100只SPF級的雄性C57BL/6N小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006；高脂飼料25kg，購自北京杰美生物科技有限公司；維持飼料10kg，購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 全自動生化儀(7600-110)(日本日立有限公司)，QuantumFX microCT (PerkinElmer)，50%葡萄糖注射液(石家莊四藥有限公司)，胰島素注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司)，血糖試紙、血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組:將100只雄性小鼠隨機(jī)分為正常組(20只)和模型組(80只)。共造模10周，每周稱量兩組小鼠的體重，造模10周后測量小鼠體長、腰圍，根據(jù)公式計(jì)算Lee’s指數(shù)[Lee’s指數(shù)=體重1/3(g)/體長(cm)×103]。

1.3.2 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(Glucose tolerance test, GTT)和胰島素抵抗實(shí)驗(yàn)(Intraperitoneal insulin tolerance test,ITT)：GTT：將小鼠禁食不禁水12h之后，按每只小鼠體重給藥(4μl/g)腹腔注射濃度為50%的葡萄糖溶液;ITT：將小鼠禁食不禁水6h之后，按每只小鼠體重給藥(0.75IU/g)腹腔注射胰島素溶液，都分別于第 0、15、30、60、90、120min 時剪小鼠尾尖的一部分獲得靜脈血，隨即用血糖試紙測量血糖值，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3 小動物CT成像(micro-CT)：麻醉小鼠并將其固定于鼠床上進(jìn)行掃描，將掃描所得的投影數(shù)據(jù)進(jìn)行重建并導(dǎo)入分析軟件進(jìn)行分析，選取參照點(diǎn)，調(diào)整密度區(qū)間，檢測小鼠皮下、腹部和內(nèi)臟脂肪的分布，然后根據(jù)各個層面進(jìn)行疊加計(jì)算得出總的脂肪體積。

1.3.4 血清生化指標(biāo)的測定：采用全自動生化儀檢測血清中ALT、AST、GGT、GLU、TC 、TG、HDL、LDL和VLDL的水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用直觀分析法和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)相結(jié)合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以α=0.05作為檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量。P<0.05時差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模期間小鼠的體重變化 表1中顯示，喂養(yǎng)高脂飼料前，兩組小鼠間體重?zé)o差異(P>0.05)，造模10周后，模型組小鼠體重比正常組高出37.2%(P<0.01)，說明單純性肥胖模型造模成功。80只模型組小鼠中，共有71只小鼠建立為單純性肥胖模型，造模成功率為88.75%。

表1 造模期間小鼠體重變化

2.2 小鼠體長、腰圍及Lee’s指數(shù)的比較 表2結(jié)果顯示，模型組小鼠的體長、腰圍、Lee’s指數(shù)均大于正常組(P<0.01)。

表2 兩組小鼠體長、腰圍及Lee’s指數(shù)的比較

2.3 兩組小鼠的脂肪體積以及分布情況 表3所示，模型組小鼠的脂肪總體積高于正常小鼠(P<0.01)，從圖1中可以看出模型組小鼠的皮下、腹部脂肪和內(nèi)臟脂肪分布明顯多于正常組小鼠。

表3 兩組小鼠脂肪總體積的比較

圖1兩組小鼠的脂肪分布圖

A為正常組，B為模型組 A4、B4是合成的立體圖 A1、B1為小鼠上切面圖 A2、B2為小鼠正切面圖 A3、B3為小鼠側(cè)切面圖

2.4 兩組小鼠肝功能酶水平的比較 表4所示，肥胖小鼠的AST、ALT水平均高于正常飲食小鼠(P<0.01)，而GGT水平無差異(P>0.05)。

2.5 兩組小鼠的血糖、血脂水平 表5所示，模型組小鼠血糖水平高于正常組小鼠(P<0.01)。模型組小鼠血清TC、HDL、LDL、VLDL含量高于正常組(P<0.01)，TG含量低于正常組小鼠(P<0.01)。

表4 兩組小鼠肝功能酶水平的比較

2.6 兩組小鼠的GTT、ITT比較 圖2顯示，GTT實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠血糖在15min時升到最高，之后正常組開始均勻下降， 模型組在30min時仍然很高，而且模型組小鼠在每個檢測的時間節(jié)點(diǎn)血糖值都高于正常組(P<0.01)。ITT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常組小鼠血糖在60min時降到最低，而模型組小鼠血糖濃度在30min時降到最低，并且模型組小鼠在每個檢測的時間節(jié)點(diǎn)血糖值都高于正常組(P<0.01)，表明模型組小鼠出了葡萄糖耐量異常和胰島素抵抗的現(xiàn)象。

表5 兩組小鼠血糖血脂水平的比較

ITT血糖變化圖

3 討論

研究證實(shí)，肥胖不僅是引發(fā)糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化等代謝性疾病的獨(dú)立危險因素，也與癌癥等疾病密切相關(guān)，已成為人類健康的絆腳石[3]。而單純性肥胖是指無其他疾病誘發(fā)，純粹是能量攝入超過消耗引起的肥胖[4]。想要更好地研究單純性肥胖的作用機(jī)制及治療方法，首先建立適宜的動物模型是研究的重要基礎(chǔ)，是揭示單純性肥胖的發(fā)生機(jī)制以及藥物治療機(jī)理的必要條件。

制備動物肥胖模型的方法較多, 如谷氨酸單鈉選擇性損傷下丘腦[5]、電刺激損傷[6]等均可制作成實(shí)驗(yàn)性肥胖動物模型，但這些方法操作復(fù)雜且均是下丘腦性肥胖模型，為模仿單純性肥胖，本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食誘導(dǎo)方式建立單純性肥胖小鼠動物模型，方法簡便易行。高脂喂養(yǎng)1周后，模型組小鼠的體重明顯增長，并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)?zāi)c對照組比平均增長 37.2%。若以體重增加20.0%作為肥胖標(biāo)準(zhǔn)，單純性肥胖小鼠造模成功率為88.75%。有研究表明肥胖會導(dǎo)致體內(nèi)血糖、血脂、肝功能指標(biāo)以及內(nèi)分泌激素水平發(fā)生一定的變化[7]，因此小鼠肥胖的衡量標(biāo)準(zhǔn)除體重、Lee’s指數(shù)外，血清中AST、ALT、GGT、GLU、TC、TG、HDL、LDL和VLDL的水平均是評價單純性肥胖動物模型是否成功的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠血清GLU、TC、HDL、LDL、VLDL水平高于正常組并與體重呈明顯正相關(guān)，血清中AST、ALT水平高于正常組小鼠，出現(xiàn)輕度肝損傷現(xiàn)象，而GGT水平無明顯變化，說明沒有嚴(yán)重的肝損傷情況，通常ALT和AST升高程度與肝細(xì)胞受損程度相一致。此外，采用micro-CT對小鼠進(jìn)行掃描，能更直觀地分析肥胖小鼠的脂肪分布情況，從圖1中可以看出模型組小鼠腹部、皮下脂肪增加較多，脂肪總體積明顯高于正常組小鼠。從圖2中的GTT與ITT血糖變化圖顯示出模型組小鼠出現(xiàn)了葡萄糖耐量異常及胰島素抵抗現(xiàn)象，但空腹血糖水平仍在正常范圍之內(nèi)(7.0～11.5mmol/L)。以上均說明了單純性肥胖小鼠模型構(gòu)建成功。

綜上所述，本研究建立的單純性肥胖小鼠模型操作簡單，造模條件量化、可控、造模周期相對較短、模型基本穩(wěn)定?？勺鳛殚_展單純性肥胖基礎(chǔ)研究的動物模型，為開發(fā)治療單純性肥胖的有效藥物提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。