楊 婕，郭金鳳，李寶坤，盧士玲，王慶玲，董 娟，蔣彩虹，姬 華，王騰斌

（石河子大學食品學院，新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832003）

乳酸菌為益生菌，人們常通過食用含該類活菌的制品或者含菌體組分及代謝產(chǎn)物的制品維持人體腸道內(nèi)菌群的平衡[1]，發(fā)酵乳制品因為具有豐富的營養(yǎng)價值與良好益生作用而受到消費者的青睞[2]，其中乳酸菌發(fā)酵劑在乳制品發(fā)酵過程中起到至關(guān)重要的作用[3]。而在發(fā)酵劑中乳酸菌的細胞數(shù)量與細胞活力則是影響發(fā)酵乳制品質(zhì)量的關(guān)鍵因。目前冷凍干燥技術(shù)被認為是最有利于保持菌種活性的方法[4]，盡管使用冷凍干燥的成本較高，但能長時間保持菌種的活力，便于貯藏和應用。

在冷凍干燥過程中，乳酸菌發(fā)酵劑難以避免冷凍與干燥過程對其造成的各種損傷。低溫使得菌體內(nèi)酶活性降低以及酶發(fā)揮作用延遲，進而可能改變代謝通路；低溫也可能降低一些代謝調(diào)節(jié)過程中的靈敏度，使代謝失衡或生長停滯[14]。這些損傷使得發(fā)酵劑中菌株的存活率降低，活力下降，造成生產(chǎn)成本增加以及產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。近年來常通過添加合適的保護劑，調(diào)整冷凍干燥工藝或者各種迫提高乳酸菌的存活率和活力，但是利用交叉保護提高乳酸菌在冷凍干燥過程中冷凍抗性方面的研究較少，因探究運用交叉保護這一方法對于乳酸菌冷凍干燥活性的提高具有一定意義。

本實驗室前期篩選出的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）ATm具有滯后時間短以及酸化速率快的特點[15]， 能夠縮短發(fā)酵時間、降低能耗，是1 株潛在的適合工業(yè)生產(chǎn)用的菌株，因選用該菌株為研究對象。通過比較不同迫條件下細胞的冷凍干燥存活率，研究不同迫條件影響發(fā)酵乳桿菌冷凍干燥后活性的差異性，為高活性乳酸菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳由新疆花園乳業(yè)提供；發(fā)酵乳桿菌ATm為石河子大學畜產(chǎn)實驗室篩選分離，NCBI登錄號為KY310724。

MRS培養(yǎng)基、固體MRS培養(yǎng)基均購自青島海博技術(shù)生物有限公司；121 ℃滅菌20 min。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒 索萊寶生物公司；ATP酶試劑盒 南京建成生物公司；LIVE/DEAD? BacLight? Bacterial Viability Kit L7012 美國Life生物公司；海藻糖 南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

F D U-1 2 0 0 冷凍干燥機 日本E y e l a 公司；NEOFUGE15R/15高速冷凍離心機 鄭州南北儀器設備有限公司；995超低溫冰箱 美國賽默飛世爾公司；IX71倒置熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；DK-8D恒溫水浴鍋 江蘇金壇儀器有限公司；PHS-3C酸度計 上海雷磁儀器廠；ZXSD-1160全自動生化培養(yǎng)箱 上海智誠儀器有限公司；EON多功能酶標儀 美國BioTek儀器有限公司；VCX750超聲波破碎儀 美國Sonics公司。

1.3 方法

1.3.1 冷凍干燥

將發(fā)酵乳桿菌ATm以3%的接種量，接種至MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)18 h，將菌液于6 791h g離心10 min，去上清液，將菌泥用生理鹽水洗滌2 次，加入等體積保護劑（脫脂乳12%海藻糖10%）。將混合有保護劑的菌懸液分裝在無菌西林瓶中，每瓶1 mL，蓋上橡膠塞，放入超低溫冰箱中預凍4 h。將預凍好的品放入冷凍干燥機中，冷凍干燥12 h，真空壓蓋，品備用。

1.3.2 冷凍干燥存活率測定

將冷凍干燥后的菌粉用MRS培養(yǎng)基復水至冷凍干燥前相同體積，用平板計數(shù)法測定冷凍干燥前后活菌數(shù)。重復3 次實驗，每次3 個平行。存活率計如式（1）所示：

式中：NA為冷凍干燥后的細胞數(shù)；NB為冷凍干燥前的細胞數(shù)。

將活化后的菌種培養(yǎng)液以3%接種量接入MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃靜置培養(yǎng)至對數(shù)末期，將菌種離心并重懸于磷酸鹽緩沖液中。將重懸液在酸迫（pH 3.2、3.8、4.0、4.5、5.0）靜置90 min，冷迫（4、10 ℃）靜置180 min，將迫后的細胞進行冷凍干燥。

1.3.5 酸化曲線測定

將冷凍干燥復水后的菌種以3%接種量接種到新培養(yǎng)基中，每隔1 h取3 支試管測量其pH值，實驗重復3 次，取平均值。以pH值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制酸化曲線。酸化曲線根據(jù)式（2）擬合[16]：

式中：t為培養(yǎng)時間/h；pH0為t=0時培養(yǎng)基的pH值；pHf為達到穩(wěn)定期時的pH值；c為對應曲線中拐點的時間/h；p為指數(shù)擬合因子。

滯后時間為曲線上t=0點切線與t=c點切線的交點，酸化速率為指數(shù)階段切線斜率的模量，按式（3）計：

式中：tc為滯后時間；tf為pH值達到穩(wěn)定期的時間。

1.3.6 相關(guān)酶活性的測定

1.3.6.1 無細胞提取液的制備

將菌體復水后離心，并用0.85%生理鹽水洗滌2 次。取5 mL于冰水浴中進行超聲波破碎（超聲時間3 s，間隔時間9 s），持續(xù)6.5 min。4 ℃、6 791h g離心10 min，取上清液進行相關(guān)酶活性測定。

1.3.6.2 LDH活性測定

采用索萊寶公司試劑盒進行測定。測定原理：LDH催化NAD氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進一步與2,4-硝基苯肼作用生成丙酮酸硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度呈正比。每104個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為1 個酶活性單位，LDH活性單位為U/104cell。

1.3.6.3 ATP酶活性測定

采用南京建成公司試劑盒進行測定。其中蛋白質(zhì)濃度根據(jù)考馬斯亮藍法[17]測定。

1.3.7 細胞膜完整性測定

利用LIVE/DEAD? BacLight? Bacterial Viability Kit L7012試劑盒測定。將等體積的熒光染料碘化丙啶和免疫熒光染料（SYT09）均勻混合。取1 μL混合染料，加入到300 μL菌懸液中，均勻混合，室溫避光孵育15 min。取5 μL已染色菌液滴加于載玻片并蓋上蓋玻片于倒置熒光顯微鏡下進行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進行分析，實驗重復3 次，顯著性分析采用Duncan檢驗。圖像處理采用Origin 2018軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因迫對冷凍干燥存活率的影響

圖 1 酸脅迫（A）和冷脅迫（B）對發(fā)酵乳桿菌ATm 冷凍干燥存活率的影響Fig. 1 Effect of acid stress (A) and cold stress (B) on the survival rate of freeze-dried L. fermentum ATm

2.2 交互迫對冷凍干燥存活率的影響

圖 2 交互脅迫對發(fā)酵乳桿菌ATm冷凍干燥存活率的影響Fig. 2 Effect of cross-stress on the survival rate of freeze-dried L. fermentum ATm

2.3 交互迫對冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm酸化曲線的影響

冷凍干燥過程中的脫水會對細胞造成不同程度的結(jié)構(gòu)損傷[25]，但僅通過平板計數(shù)評估交互迫對乳酸菌活性保護的能力有局限性。因，對冷凍干燥后的乳酸菌進行酸化曲線測定可提供細菌修復損傷的能力和冷凍干燥后活性恢復的情況[16]。

菌株冷凍干燥并復水后，每小時測定細胞培養(yǎng)液pH值變化，選取迫處理菌株、未經(jīng)冷凍干燥原始菌株和未經(jīng)迫處理的冷凍干燥菌株（對照），得到菌株的酸化曲線（圖3）。

圖 3 交互脅迫對冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm酸化曲線的影響Fig. 3 Effect of cross-stress on acidification curves of freeze-dried L. fermentum ATm

表 1 交互脅迫對發(fā)酵乳桿菌ATm生長動力學參數(shù)的影響 Table 1 Effect of cross-stress on growth kinetic parameters of freeze-dried L. fermentum ATm

如表1所示，未冷凍干燥的原始菌株滯后時間最短，酸化速率（每小時pH值變化量）最快，分別為2.02 h、0.68。相反，未經(jīng)迫處理的冷凍干燥乳酸菌滯后時間最長，酸化速率最慢，分別為7.50 h、0.23。任何處理下冷凍干燥后微生物的滯后時間都有不同程度的延長，且酸化速率減慢。這可能是因為冷凍干燥的脫水過程使得乳酸菌的細胞膜受到損傷，以及酶活力下降[26]，使得乳酸菌在冷凍干燥后的產(chǎn)酸能力受到影響。經(jīng)過交互迫處理后的乳酸菌滯后時間和酸化速率與原始菌株相近，分別為 2.73 h、0.53，該處理比其他迫的保護方式更有效，說明用交互迫的前處理方式保護冷凍干燥乳酸菌的活性是很有必要的。

2.4 交互迫對冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm LDH活性的影響

圖 4 交互脅迫對冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm LDH活性的影響Fig. 4 Effect of cross-stress on LDH activity of freeze-dried L. fermentum ATm

2.5 交互迫對冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm ATP酶的影響

ATP酶是一種廣泛分布的生物膜酶系統(tǒng)，對于維持細胞正常生理功能有至關(guān)重要的作用[20]。Na-KATP酶又稱Na-K泵或者鈉泵，鑲嵌在細胞質(zhì)膜的脂質(zhì)雙分子層中，能夠催化ATP酶水解供給能量，有載體和酶的活性，在維持膜電位、調(diào)節(jié)滲透壓以及為主動運輸供能方面起著重要的作用[29]。Ca2-Mg2ATP酶能夠調(diào)節(jié)Ca2和Mg2的濃度，也是重要的膜酶[30]。因ATP酶是冷凍干燥過程中損傷的關(guān)鍵酶之一，本研究測定冷凍干燥后 Na-KATP酶與Ca2-Mg2ATP酶的活性結(jié)果見圖5。

圖 5 交互脅迫對冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm Na＋ -K＋ATP酶（A）和Ca2＋-Mg2＋ATP酶（B）活性的影響Fig. 5 Effect of cross-stress on Na+-K+ATPase (A) and Ca2+-Mg2+ATPase (B) activities of freeze-dried L. fermentum ATm

2.6 交互迫對冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm細胞膜完整性的影響

細胞膜能夠?qū)⒓毎麅?nèi)外的環(huán)境隔離開，對于細胞的生殖，能量傳遞及物質(zhì)代謝等具有重要作用[31]，是細胞遭受外界環(huán)境迫害的第一道防線，細胞膜的破壞會直接導致菌體的死亡，因細胞膜完整性真實地反映了菌體生理活性[32]。當細胞膜完整性被破壞時，碘化丙啶能夠透過生物膜與核酸結(jié)合在綠光的照射下發(fā)出紅色熒光，所以當熒光顯微鏡觀察到細胞呈紅色，說明細胞膜完整性被破壞[33]。

圖 6 交互脅迫對冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm細胞膜完整性的影響Fig. 6 Effect of cross-stress on cell membrane integrity of freeze-dried L. fermentum ATm

3 結(jié) 論