駱仁軍，姜 濤，陳修報，薛竣仁，劉洪波，楊 健,,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評價與資源養(yǎng)護重點實驗室，淡水漁業(yè)研究中心，江蘇 無錫 214081）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），又名河蟹、大閘蟹，方蟹科，絨螯蟹屬。因其獨特的風(fēng)味和富含多種礦質(zhì)元素[1]，成為中國水產(chǎn)品的一大支柱產(chǎn)業(yè)。中華絨螯蟹廣泛養(yǎng)殖于在長江、黃河、遼河等水系中，并以長江水系為主[2]。2017年在中國的養(yǎng)殖年產(chǎn)量已達75萬 t，養(yǎng)殖產(chǎn)量超過1萬 t的6 個省份江蘇、湖北、安徽、遼寧、江西和山東占總產(chǎn)量的93%，其中位于遼河水系的遼寧占7%，黃河水系的山東占2%[3]。目前，受國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護認證和保護的中華絨螯蟹產(chǎn)地品牌已有二十多個，如陽澄湖、固城湖、梁子湖、盤錦等，可以對各知名品牌螃蟹起到很大的保護作用。但是，在中華絨螯蟹編碼系統(tǒng)的實際應(yīng)用中，常會因標(biāo)簽的丟失、標(biāo)簽信息不完全、甚至虛假標(biāo)簽等原因造成信息鏈的缺失或中斷，導(dǎo)致類似于陽澄湖“洗澡蟹”等的問題屢禁不止。因此，需要研究更多更具客觀性、獨立性的方法，有效顯示大閘蟹產(chǎn)品自身特質(zhì)的產(chǎn)地差異性，進而有助于鑒別其真正的產(chǎn)地來源信息，對相關(guān)正常而公正的市場秩序進行有效監(jiān)督。

目前，對不同和相同水系產(chǎn)地之間中華絨螯蟹的差異，在形態(tài)[4]、DNA[2]、脂肪酸[5]以及電子舌、 電子鼻[6-7]等方面均已經(jīng)有了一些探索研究。本實驗室在以前的研究[4,8-10]中利用形態(tài)學(xué)和多種礦質(zhì)元素兩種方法主要對來自長江水系的中華絨螯蟹進行產(chǎn)地判別研究，但對黃河、遼河水系的中華絨螯蟹還缺乏研究。同時，為提高產(chǎn)地鑒別效果，穩(wěn)定同位素分析技術(shù)也需要應(yīng)用于中華絨螯蟹的產(chǎn)地溯源研究中[11]。此外，礦質(zhì)元素含量和穩(wěn)定同位素比率“指紋”的結(jié)合分析甚至可提高海鱒[12]、蝦[13]等水產(chǎn)品的產(chǎn)地判別準(zhǔn)確率。

化學(xué)計量學(xué)的常用分類方法中，K-mean聚類分析、主成分分析、自組織映射（self-organizing map，SOM）等屬于無監(jiān)督分類模型；線性判別分析、支持向量機、軟獨立模型、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等屬于有監(jiān)督分類模型。其中，SOM是一種競爭學(xué)習(xí)型的無監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，它提供了高維數(shù)據(jù)投影在低維空間的可視化方法，且保留了初始拓撲結(jié)構(gòu)性質(zhì)，可以將高維空間中相似的樣本點映射到網(wǎng)絡(luò)輸出層中的鄰近神經(jīng)元[14]，目前水質(zhì)時空分布[15-16]研究中有了較多的分析；而在模式分類也有越來越多的研究，如在森林健康等級[17]、茶葉分類[18]，火山巖巖性識別[19]，專利文本聚類[20]等。線性判別分析最早由Fisher提出，其思路是根據(jù)已知類別樣品的性質(zhì)，利用某種技術(shù)建立函數(shù)式，然后對未知類別的新事物進行判斷，并將之歸入已知類別中，是一種比較成熟并在化學(xué)計量學(xué)中應(yīng)用較廣的模式識別方法[21-22]，屬于有監(jiān)督的模式識別方法。

因此，本研究嘗試用單因素方差分析及Duncan多重比較檢驗分析穩(wěn)定同位素比和礦質(zhì)元素含量的產(chǎn)地間差異，然后利用SOM方法將12維特征因子投射到合適的二維空間中并進行分類，同時對礦質(zhì)元素和穩(wěn)定同位素等產(chǎn)地特征因子等參數(shù)進行可視化分析，最后對中華絨螯蟹進行逐步判別分析，并篩選出用于建立判別模型的礦質(zhì)元素和穩(wěn)定同位素，以期進一步完善中華絨螯蟹的產(chǎn)地判溯源模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

遼寧省盤錦蟹樣于2016年11月采自大洼縣大閘蟹蟹-稻共作養(yǎng)殖區(qū)；遼寧省營口蟹樣于2015年11月采自營口市蟹-稻共作養(yǎng)殖區(qū)；山東省東營蟹樣于2016年5月采自東營市墾利區(qū)永安鎮(zhèn)黃河口大閘蟹市場，均為符合農(nóng)業(yè)部2008年農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志公告第1119號規(guī)定，捕撈自黃河口自然水域的野生黃河口大閘蟹。參考GB/T 19957ü 2005《地理標(biāo)志產(chǎn)品 陽澄湖大閘蟹》[23]所的原產(chǎn)蟹定義（即至少從扣蟹養(yǎng)到成蟹保持同一水域），以上3 地蟹樣均為相應(yīng)產(chǎn)地的原產(chǎn)大閘蟹，蟹齡至少2 齡。

濃硝酸（質(zhì)量分數(shù)65%，優(yōu)級純） 德國Merck公司； 穩(wěn)定同位素標(biāo)樣：IAEA600咖啡因 國際原子能機構(gòu)；錫箔杯 美國Thermo Fisher Scientific公司；內(nèi)標(biāo)Li、Sc、Ge、Y、In、Bi（優(yōu)級純）、環(huán)境標(biāo)樣（Part#5183ü 4682） 美國Agilent公司；NRC DOLT-5鯊魚肝微量元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 加拿大國家研究委員會。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；穩(wěn)定同位素質(zhì) 譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；ETHOS A T260微波消解儀 意大利Milestone公司；7500ce電感耦合等離子質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）儀 美國Agilent公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA32048電子天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；超純水（電阻率18.2 MΩg cm/25 ℃）機 美國Millipore公司；瑪瑙研缽 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；電子干 燥機 日本AS ONE公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

對各產(chǎn)地的樣本（N＝20），測定規(guī)格大小，選取雌雄各10 只中華絨螯蟹運回實驗室，以封口袋單只收納后統(tǒng)一放置于魚苗袋內(nèi)，保存于－20 ℃冰箱中。參照 專利[24]方法進行樣本的前處理，統(tǒng)一使用整體第3步足（同時含蟹殼和蟹肉）作為元素測量的試樣[8-11]。體長體寬和第3步足的測定參考堵南山[25]的論述。具體操作為首先剪取完整的單只第3步足，用超純水清洗6 遍，然后在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中以80 ℃烘干24 h至質(zhì)量恒定，最后用瑪瑙研缽碾磨成粉末狀干樣，置于干燥器中保存待用。螃蟹的基本信息見表1。

表 1 中華絨螯蟹樣本基本信息Table 1 Biological traits of Eriocheir sinensis

1.3.2 穩(wěn)定同位素測定

稱取0.2 mg樣品放入錫箔杯中，通過穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀，進行檢測。質(zhì)譜儀條件為燃燒爐溫度980 ℃、還原爐溫度50 ℃、載氣He流量100 mL/min。依據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）指導(dǎo)[26]，穩(wěn)定同位素比率計算如下：

式中：E代表穩(wěn)定同位素，R為重同位素與輕同位素豐度比，即13C/12C和15N/14N。δ13C的相對標(biāo)準(zhǔn)為Vienna Pee Dee Belemnite standard（VPDB），δ15N的相對標(biāo)準(zhǔn)是空氣中N2。測定時，δ13C和δ15N的10 次重復(fù)測定 精度低于0.0 6‰。分析過程中，每2 0 樣品穿插一個實驗室標(biāo)樣IAEA600咖啡因進行質(zhì)量控制。為了校正數(shù)據(jù)，如果數(shù)值不在標(biāo)樣咖啡因（δ13CVPDB， （－27.771f 0.043）‰；δ15Nair，（1.0f 0.2）‰）的范圍內(nèi)，參考氣會被重新標(biāo)定。

1.3.3 礦質(zhì)元素測定

稱?。?.1f 0.005）g干樣置于消解管中，加入5 mL硝酸，進行微波消解，然后定容至100 mL待測。用7500ce電ICP-MS測定10 種礦質(zhì)元素（Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Cu、Zn、Sr、Ba）的濃度。用外標(biāo)法進行定量分析，以環(huán)境標(biāo)樣為標(biāo)準(zhǔn)樣品，用內(nèi)標(biāo)元素Li、Sc、Ge、Y、In、Bi保證儀器的穩(wěn)定性。標(biāo)準(zhǔn)樣品分析中元素的線性相關(guān)性均高于0.999，相對標(biāo)準(zhǔn)差小于5%。利用元素標(biāo)準(zhǔn)添加回收法測定上述各種元素的回收率均在97%～120%之間。同時，標(biāo)樣（NRC DOLT-5鯊魚肝微量元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）對Na、Mg、K、Ca、Cu、Zn等元素測定的回收率在75%～120%之間。

1.4 多元統(tǒng)計分析

采用軟件MATLAB 9.0中利用SOM Toolbox2.0工具包進行SOM分析，數(shù)據(jù)處理與分析參照[15]；在SPSS 20.0軟件對3 個產(chǎn)地中華絨螯蟹穩(wěn)定同位素比和礦質(zhì)元素含量進行單因素方差分析和Duncan多重比較檢驗，判別分析前數(shù)據(jù)的預(yù)處理利用SPSS 20.0軟件對穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素進行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化[10]，并將歸一化的結(jié)果進行逐步判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素產(chǎn)地差異分析

本研究對3 個產(chǎn)地中華絨螯蟹第3步足樣本利用IRMS進行了碳、氮穩(wěn)定同位素比的測定，在所有螃蟹樣品中δ15N結(jié)果范圍是1.7‰～14.6‰，δ13C范圍 是－22.9‰～－14.0‰。不同產(chǎn)地穩(wěn)定同位素比δ13C和δ15N的均值和標(biāo)準(zhǔn)差見表2。在單因素方差分析中，δ13C和δ15N均差異極顯著（P＜0.001）。從研究結(jié)果可以看出東營樣本同時具有最低的δ13C和δ15N，盤錦的螃蟹δ15N值較高，營口的螃蟹δ13C值最高。通過單因素方差分析，在3 個產(chǎn)地間，δ13C和δ15N均差異極顯 著（P＜0.001），Duncan多重比較顯示δ13C在不同水系的產(chǎn)地間差異顯著（P＜0.05），來自同一水系的盤錦和營口螃蟹的δ13C差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于東營（P＜0.05），而δ15N在3 個產(chǎn)地間均差異顯 著（P＜0.05)，且盤錦＞營口＞東營。

同時，研究中還利用ICPMS分析了Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Cu、Zn、Sr、Ba 10 種礦質(zhì)元素的含量（表2）。由于選取完整的第3步足作為樣本，螃蟹的外骨骼占比較大，Ca元素含量最高。通過單因素方差分析，在3 產(chǎn)地間Na、Al、Zn、Sr、Ba均差異極顯著 （P＜0.01），K、Mg差異顯著（P＜0.05），Ca、Mn、Cu差異不顯著（P＞0.05）。Duncan多重比較顯示，東營Na元素顯著低于盤錦和營口（P＜0.05），盤錦和營口之間差異不顯著（P＞0.05）。Zn、Sr、Ba元素產(chǎn)地間的差異明顯，其中東營的Zn是盤錦和營口的1.5～2 倍，Sr是盤錦和營口的2 倍，Ba元素含量也達到了盤錦和營口的3 倍左右，而Zn、Sr、Ba在營口和盤錦間差異不明顯，但是Mg、Al、Mn在盤錦和營口之間差異極顯著。

表 2 不同產(chǎn)地中華絨螯蟹穩(wěn)定同位素比和礦質(zhì)元素含量（干質(zhì)量）Table 2 Multi-stable isotope ratios and mineral element concentrations (on a dry mass basis) in third pereiopod of E. sinensis from different geographic origin

2.2 自組織神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析

圖 1 螃蟹樣本的SOM聚類分布圖Fig. 1 Cluster distribution of self-organizing mapping of E. sinensis from different geographic origins

利用2 種穩(wěn)定同位素和1 0 種礦質(zhì)元素，并運用自組織神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對中華絨螯蟹進行聚類分 析（圖1）。本研究中網(wǎng)絡(luò)大小選擇按量化誤差（quantization error，QE）和拓撲誤差（topographic error，TE）最小的原則[27]，40（8h 5） 個神經(jīng)元大小（響應(yīng)3 個產(chǎn)地樣本60 個樣品）可得到最好的網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練效果，QE和TE值分別為0.436、0.017。

在SOM分析時，常用聚類算法評價指標(biāo)（Davies-Bouldin index，DBI）指數(shù)的最小值確定聚類數(shù)[28]。穩(wěn)定同位素SOM分析的最小DBI指數(shù)為0.865 6，聚類組為4；礦質(zhì)元素SOM分析的最小DBI指數(shù)為0.841 9，聚類組為2；結(jié)合穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素SOM分析的最小DBI指數(shù)為0.851 6，聚類組為2 類。通過調(diào)整聚類數(shù)，SOM分析了從聚類數(shù)為4 類到2 類的情況（圖1）。僅利用穩(wěn)定同位素同位素則是將大部分東營樣本（圖1a、I、IV）和少部分營口和盤錦樣本（圖1a、I、II）分為一大類，無法將兩水系聚為2 類（圖1a）。結(jié)合穩(wěn)定同位素比和礦質(zhì)元素或僅利用元素可以將黃河水系的東營樣本單獨聚為一類（圖1b、c），將遼河水系的盤錦和營口兩個產(chǎn)地樣品聚為一類。僅礦質(zhì)元素則是將東營分為3 類（圖1b、II、III、IV），再與遼河水系兩個產(chǎn)地的樣本（圖1b、I）進一步聚類；結(jié)合穩(wěn)定同位素比和礦質(zhì)元素，東營被分為2 類（圖1c，I、II），同時有大部分盤錦樣本被區(qū)分出來（圖1c、III）。結(jié)合穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素其分類效果優(yōu)于僅使用礦質(zhì)元素，僅用同位素效果明顯地差于僅用元素或結(jié)合穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素。

圖 2 參數(shù)可視化分析Fig. 2 Visual analysis of component planes

為了直觀地展示12 種成分在3 個不同產(chǎn)地間的分布規(guī)律，采用SOM聚類分析對這些產(chǎn)地差異因子進行了分析。通過不同樣品12 個參數(shù)在神經(jīng)元上的響應(yīng)圖，可泛化、可視化各聚類組的時空變化，利用這12 種成分的分布將產(chǎn)地分為4 組。而且，可進一步觀察不同產(chǎn)地的螃蟹樣品參數(shù)信息，如圖2a所示，圖中顏色越接近紅色表示相對含量越高，顏色越接近藍色表示相對含量越低。顯然，礦質(zhì)元素和穩(wěn)定同位素在4個螃蟹分布組別上可被進一步識別，如Zn、Sr、Ba等元素具有相似特征，在東營分布區(qū)域（圖2b、I、II）元素含量明顯高于盤錦和營口，Na元素則相反。其他元素分布特征各不相同，δ13C第III類中明顯高于其他區(qū)域，Mg在I和II分界處較高，在IV中則比較低。Al在I、II、III均有重疊。

2.3 線性判別分析

采用線性判別分析法對δ13C和δ15N建立判別模型如 表3所示，顯示其判別準(zhǔn)確率為66.7%，說明此兩個因子能一定程度的區(qū)分3 個產(chǎn)地，但是較多的誤判樣本，交叉驗證正確率僅為65.0%，東營和營口以及盤錦和營口均有較多的誤判。而本研究礦質(zhì)元素分析的10 個元素結(jié)合線性判別分析，可以得到95.0%的正確率，然而，其交叉驗證的總體正確率僅為85.0%，說明線性判別模型的穩(wěn)定還需進一步提高。在結(jié)合穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素之后，線性判別模型的正確率可以達到96.7%，交叉驗證的正確也提高到91.7%，模型的初始正確率和交叉驗證正確率均得到了提高。

表 3 不同產(chǎn)地中華絨螯蟹穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素的線性判別分析Table 3 Linear discriminant analysis by stable isotope or/and trace element profiles of E. sinensis from different geographic origins

圖 3 線性判別分析Fig. 3 Linear discriminant analysis

僅利用礦質(zhì)元素通過逐步判別分析，可以篩選出Na、Al、K、Zn、Sr、Ba 6 種礦質(zhì)元素用于建立判別函數(shù)，得到的函數(shù)1的方差貢獻率是82.2%，函數(shù)2的方差貢獻率是17.8%。利用函數(shù)1和函數(shù)2作散點圖（圖3a）。在結(jié)合礦質(zhì)元素與同位素進行線性判別分析中，通過逐步判別分析，篩選出δ13C、δ15N、K、Zn、Ba 5 個因子用于建立判別函數(shù)。函數(shù)1的方差貢獻率是84.3%，函數(shù)2的方差貢獻率是15.7%。利用函數(shù)1和函數(shù)2作散點圖（圖3b）。圖3顯示，僅利用礦質(zhì)元素或結(jié)合礦質(zhì)元素與同位素的產(chǎn)地區(qū)分效果均十分明顯，僅個別樣品交叉，各產(chǎn)地內(nèi)樣本基本被完全區(qū)分。

3 討 論

由于δ13C和δ15N穩(wěn)定同位素差異的來源主要飼料種類的影響[29]，C同位素組成與動物飼料種類密切相關(guān)可以表征飼料中C3、C4植物所占的比例，N穩(wěn)定同位素與動物的營養(yǎng)級以及土壤中氮和氮肥的使用有關(guān)。本研究中，螃蟹樣品δ15N結(jié)果范圍為1.7‰～14.6‰，δ13C范圍為－22.9‰～－14.0‰，Duncan多重比較顯示來自同一水系盤錦和營口螃蟹的δ13C差異不顯著（P＞0.05），與東營之間差異顯著（P＜0.05），而δ15N在3 個產(chǎn)地間均差異顯著（P＜0.05），樣品間比值的差異可以顯示出生活在不同環(huán)境中的螃蟹對穩(wěn)定同位素分餾效應(yīng)的差異。在曾文濤[30]研究中，δ13C和δ15N與中華絨螯蟹食物和生活環(huán)境密切相關(guān)，其同位素組成的產(chǎn)地差異可能與中華絨螯蟹食物的不同有關(guān)，因為野生中華絨螯蟹能捕獲的食物隨生活環(huán)境變化而有所改變，而人工養(yǎng)殖的中華絨螯蟹則長期食用池塘中固有生存的小型雜食魚類、人工飼料以及昆蟲，說明了δ13C和δ15N的值與中華絨螯蟹食物和生活環(huán)境相關(guān)程度非常高。環(huán)境中土壤、水、飼料、廢棄物以及空氣中的礦質(zhì)元素組成和含量都有其各自的 特征[31]，而環(huán)境中的痕量元素在動物體中不斷累積，造成不同地域來源的動物體內(nèi)元素含量有較大差異[32]。同時人為因素也具有很大影響，不同配合飼料、添加劑、肥料以及工農(nóng)業(yè)廢棄物等會增加或者掩蓋不同產(chǎn)地的元素差異性。本研究中，通過單因素方差分析，Na、Al、Zn、Sr、Ba均差異極顯著（P＜0.01），K、Mg差異顯著（P＜0.05），可應(yīng)用于產(chǎn)地溯源研究。Zn、Sr、Ba元素產(chǎn)地間的差異明顯可以用于區(qū)分東營，但是盤錦和營口差異不顯著。而Mg、Al、Mn在盤錦和營口之間差異極顯著，可以用于區(qū)分盤錦和營口。

SOM分析已廣泛用于水質(zhì)時空分布和模式分類等領(lǐng)域[15-20]，利用其可視化功能，可直觀探討時空格局變化，彌補傳統(tǒng)分類的不足。同時，SOM提供了高維數(shù)據(jù)投影在低維空間的可視化方法，且保留了初始拓撲結(jié)構(gòu)性質(zhì)[14]。另外，還可進一步分析樣品的空間距離遠近。在構(gòu)建分類模式時，神經(jīng)元的合適聚類（反映樣品聚類）影響分類模式的分辨能力，如果神經(jīng)元數(shù)量太多，則容易造成過擬合，如果太少，則無法發(fā)現(xiàn)一些重要的 差異[33]。Vesanto等[34]提議最佳的神經(jīng)元數(shù)量接近 5

（n為樣品數(shù)量），本實驗樣品數(shù)量為60，因此神經(jīng)元的數(shù)量應(yīng)該接近38。網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)元的大小更重要的方法是按QE和TE最小的原則[27]，網(wǎng)絡(luò)越大時，因神經(jīng)元越多，其對輸入樣品的分辨能力越強，QE變小，而TE則不同，其反映的是當(dāng)不同樣品輸入時，所構(gòu)建的SOM網(wǎng)絡(luò)保持拓撲結(jié)構(gòu)的能力，最終本研究選擇的神經(jīng)元大小為40（8h 5）。SOM常用DBI指數(shù)的最小值確定 聚類數(shù)[28]，而結(jié)合穩(wěn)定同位素和元素分析時，最小DBI指數(shù)為0.851 6，最優(yōu)分類為2 類，可以將黃河水系樣品和遼河水系樣品區(qū)分為兩類。穩(wěn)定同位素比和元素含量在神經(jīng)元上的可視化將Duncan多重比較中Na、Al、Zn、Sr、Ba、K、Mg顯著性差異結(jié)果在不同類別圖上表現(xiàn)出來?？梢暬治隹梢院芎玫卣故境煞值漠a(chǎn)地間差異，張悅等[35]通過不同產(chǎn)地香茶關(guān)鍵香氣成分熱圖對各種成分進行了可視化顯示，同時進行了層次聚類，分析了各產(chǎn) 地香氣成分的差異及其相關(guān)性。本研究表明SOM的分類和可視化分析，在中華絨螯蟹的產(chǎn)地溯源中將具有較好的應(yīng)用潛力。

穩(wěn)定同位素與礦質(zhì)元素均是可以用于水產(chǎn)品產(chǎn)地溯源的方法[21-22]。C、N穩(wěn)定同位素比還未應(yīng)用于中華絨螯蟹的產(chǎn)地溯源中，但在其他水產(chǎn)品的應(yīng)用中，如Sant’Ana等[36]運用IRMS技術(shù)對人工養(yǎng)殖和野生的巴西淡水鯰魚進行區(qū)分結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著季節(jié)變化δ13C比δ15N有更好的溯源效果，通過結(jié)合C、N同位素的二維圖像分析可提高溯源正確率。本實驗對中華絨螯蟹δ13C和δ15N的結(jié)果進行判別分析，顯示其判別準(zhǔn)確率為66.7%，說明此兩個因子能一定程度的區(qū)分3 個產(chǎn)地，但是存在較多的誤判樣本；交叉驗證準(zhǔn)確率僅為65.0%，說明并不能僅靠這兩個因子做中華絨螯蟹的產(chǎn)地溯源，需要分析更多地穩(wěn)定同位素或者與其他溯源方法結(jié)合。元素在中華絨螯蟹的產(chǎn)地溯源中具有較好的效果，有研究人員[8-10]對長江水系與其他不同湖泊所產(chǎn)的中華絨螯蟹群體的第3步足當(dāng)做試樣利用電感耦合等離子質(zhì)譜儀測定了21 種元素的含量，均利用了本研究中的10 種元素進行產(chǎn)地判別分析，結(jié)果顯示中華絨螯蟹第3步足元素含量和分布的不同湖泊間差異極為顯著，同時初步建立了的判別公式對產(chǎn)中華絨螯蟹進行了判別，判別準(zhǔn)確率80%～100%。本實驗研究結(jié)果顯示，單獨利用元素指紋對3 個產(chǎn)地進行判別分析，其綜合判別率達到95%，證明使用第3步足的元素分析能較大程度對黃河以及遼河水系不同養(yǎng)殖環(huán)境下中華絨螯蟹進行產(chǎn)地區(qū)分。然而，其交叉驗證的正確率僅為85%，說明線性判別模型的穩(wěn)定性還需進一步提高。研究結(jié)合穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素之后，線性判別模型的正確率可以達到96.7%，交叉驗證的正確也提高到91.7%，模型的正確率和穩(wěn)定性均得到了提高。同時，線性判別分析可以對產(chǎn)地判別因子進行篩選，Curtis等[12]利用線性判別分析篩選了海鮭魚耳石結(jié)構(gòu)中的δ13C和δ18O同位素比值和7 個礦質(zhì)元素（Ba、B、Mn、K、Rb、Na、Sr）進行研究，表明耳石化學(xué)可能是區(qū)分野生斑點海鮭魚產(chǎn)卵場的有力工具。Ortea等[13]借助線性判別分析分析了δ13C、δ18N、As、Cd、Pb、P、S 7 個變量，實現(xiàn)了蝦的最佳判別，作者指出δ13C、δ18N、As、Cd、Pb、P、S等元素的結(jié)合分析可作為產(chǎn)地溯源指標(biāo)。本研究僅利用元素通過逐步判別分析，篩選出Na、Al、K、Zn、Sr、Ba 6 種礦質(zhì)元素用于建立判別函數(shù)。同時，通過對兩種穩(wěn)定同位素和10 種礦質(zhì)元素的逐步判別分析，僅利用δ13C、δ15N、K、Zn、Ba建立的判別函數(shù)可以得到交叉驗證正確率91.7%的產(chǎn)地判別效果，這些礦質(zhì)元素或穩(wěn)定同位素比的單因素方差分析在產(chǎn)地間均差異顯著（P＜0.05）或差異極顯著（P＜0.01），并且在SOM的可視化分析中，這些元素在不同分類區(qū)域中差異明顯。

4 結(jié) 論

通過對黃河和遼河3 個產(chǎn)地的中華絨螯蟹進行穩(wěn)定同位素比和礦質(zhì)元素分析，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)對中華絨螯蟹進行產(chǎn)地鑒別。結(jié)果表明：通過單因素方差分析及Duncan多重比較檢驗，3 個產(chǎn)地間Na、Mg、Al、K、Zn、Sr、Ba 7 個礦質(zhì)元素以及δ13C和δ15N 2 個穩(wěn)定同位素比在產(chǎn)地間有顯著差異，而Ca、Mn、Cu 3 個元素差異不明顯。而在SOM神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)聚類分析中，單獨利用元素或結(jié)合穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素的最佳聚類效果均可將黃河口東營聚為一類，遼河的盤錦和營口的樣本聚為另一類，同時可視化分析展示了穩(wěn)定同位素比和礦質(zhì)元素在產(chǎn)地間的差異性分布，研究表明SOM的無監(jiān)督分類和可視化分析，在中華絨螯蟹的產(chǎn)地鑒別中將具有較好的應(yīng)用前景。逐步判別分析分別對穩(wěn)定同位素、礦質(zhì)元素以及結(jié)合穩(wěn)定同位素和元素進行分析，僅利用礦質(zhì)元素通過逐步判別分析，篩選出Na、Al、K、Zn、Sr、Ba 6 種礦質(zhì)元素用于建立判別函數(shù)可以區(qū)分3 個產(chǎn)地，正確率達到95%，而結(jié)合穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素篩選出δ13C、δ15N、K、Zn、Ba 5 個因子用于建立的判別函數(shù)具有更高的產(chǎn)地判別正確率，正確率達到96.7%，因此單利用元素或穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素均可以進行中華絨螯蟹的產(chǎn)地鑒別，且穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素的結(jié)合具有更高的產(chǎn)地鑒別潛力。本研究結(jié)果對黃河和遼河水系乃至全國的中華絨螯蟹地理標(biāo)志產(chǎn)品保護和“洗澡蟹”等的鑒別方面將可提供重要的參考依據(jù)和理論支撐。