付 欣， 周 浩， 鐘 清， 祝欣然， 涂 芬， 楊 芳,*

(1.武漢工程大學(xué) 環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院/化工與制藥學(xué)院， 湖北 武漢 430205；2.海南大學(xué) 熱帶島嶼資源先進(jìn)材料教育部重點實驗室， 海南 海口 570228)

原花青素(proanthocyanidins，PC)是從植物中提取出的多酚化合物，是一種理想的天然抗氧化劑[1]，能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合防止過氧化，也可清除自由基及螯合金屬離子，還能抑制紅細(xì)胞膜過氧化，預(yù)防心腦血管等疾病[2]。原花青素可以替代化學(xué)合成的防腐劑，還可以作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，具有保護(hù)肝腎、抗衰老、降低膽固醇、紫外線防護(hù)以及抗癌等功能，因此被廣泛應(yīng)用于食品、藥品以及化妝品等領(lǐng)域。然而，由于原花青素主要在小腸被吸收，過早被口腔或胃中消化液破壞不僅會降低其在機(jī)體內(nèi)的抗氧化活性[3]，還會降低其在小腸的吸收率，從而降低生物利用率[4]。因此，可將其封裝在一個可控釋放的載體系統(tǒng)中進(jìn)行輸送，從而避免其在消化過程中因在口腔和胃液中的分解而降低其小腸吸收效率，增強(qiáng)其在腸道中的抗氧化效果[5]。2001年Vallet-Regi等首次使用介孔納米二氧化硅顆粒作為載體進(jìn)行緩釋研究以來，人們對MSNs作為藥物緩控載體進(jìn)行了深入研究[6]。MSNs具有較高的比表面積和孔體積，可調(diào)的孔徑范圍等獨特性能，可作為載體在生物活性物質(zhì)緩釋及靶向釋放的方面顯示了巨大的應(yīng)用前景[7]。有相關(guān)研究制備的空心SiO2顆粒結(jié)構(gòu)形貌良好，空腔結(jié)構(gòu)大，能從姜黃素溶液中吸附姜黃素[8]。原花青素等多酚類物質(zhì)在消化中，高濃度有利于提高其在腸細(xì)胞的生物活性[9]，將其包埋到給藥系統(tǒng)中能大幅度提高其生物利用率[10]。本研究將PC負(fù)載于MSNs中，制備PC- MSNs復(fù)合體，并研究其在模擬胃腸道(gastrointestinal tract，GIT)消化體系中的釋放，PC- MSNs復(fù)合體能耐受胃部的酸性環(huán)境，順利到達(dá)小腸釋放PC，為提高PC的生物利用率提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

甲醇(分析純)、十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)、四乙氧基硅烷(tetraethoxysilane，TEOS)、氯化銨、濃硫酸(分析純)、濃鹽酸(分析純)、胃蛋白酶(1 200 U/g)、胰蛋白酶(5×104U/g)、膽汁提取物，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品葡萄籽PC(純度≥95%)、香蘭素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。TG16- WS型離心機(jī)，長沙湘智離心機(jī)股份有限公司；AutosorbIQ型比表面積與孔隙度分析儀，美國康塔儀器有限公司； JEM2100型透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；TSI9302A型霧化氣溶膠發(fā)生器，美國TSI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1MSNs載體的制備

采用氣溶膠法制備MSNs[11]。稱取4.0 g CTAB，依次加入1.12 g 1 mol/L鹽酸溶液、22.8 g無水乙醇、56 g蒸餾水、10.4 g TEOS、4.0 g NH4Cl，攪拌均勻，得到前軀體溶液。將上述溶液置于霧化氣溶膠發(fā)生器中，使氣溶膠液滴生成，以氮氣為載體，氣溶膠液滴被干燥，并凝固在管式爐中(保持400 ℃)，得到白色顆粒。將白色顆粒在500 ℃，5小時煅燒去除CTAB和氯化銨，得到MSNs載體。

1.2.2表面特性分析

采用比表面積與孔隙率分析儀，通過測定MSNs及其PC- MSNs復(fù)合體對氮氣的吸附特性來表征其多孔性。樣品于 60 ℃下脫氣15 min，以去除吸附水，然后進(jìn)行測定，比表面積和孔體積大小根據(jù)Brunauer- Emmett- Teller (BET)方法分析[12]。

1.2.3MSNs的透射電子顯微鏡分析

采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)對MSNs的孔道結(jié)構(gòu)及孔徑進(jìn)行分析[13]，將MSNs用無水乙醇溶解后，采用超聲波進(jìn)行分散，將樣品溶液沉積到鍍有碳膜的銅網(wǎng)上，于45 ℃干燥2 h后進(jìn)行抽真空處理，在加速電壓200 kV下觀察。

1.2.4MSNs負(fù)載PC工藝優(yōu)化

采用浸漬法將PC負(fù)載于MSNs中，制備PC- MSNs。稱取一定質(zhì)量的MSNs于離心管中，分別加入1 mL PC溶液，對該體系進(jìn)行單一溫度處理或變溫交替處理以促進(jìn)負(fù)載過程。其中，單一溫度處理程序為：分別將樣品置于一定溫度處理2 h。變溫交替處理程序為：較高溫處理0.5 h，然后4 ℃處理0.5 h，此為一次變溫刺激，重復(fù)兩次，共2 h。將負(fù)載后的溶液9 000 r/min離心10 min，采用硫酸- 香草醛比色法[14-15]測其上清液中的PC含量，通過PC含量計算PC負(fù)載率和負(fù)載量。

負(fù)載率=(1-Ai/A0)×100%。

(1)

負(fù)載量=負(fù)載率×ρ(原花青素)×
溶液體積/m(二氧化硅納米顆粒)。

(2)

式(1)中，Ai為上清液在500 nm處的吸光度值，A0為原花青素溶液在500 nm處的吸光度值。

1.2.5PC-MSNs的體外釋放實驗

體外模擬GIT消化過程包括模擬口腔消化、模擬胃消化以及模擬小腸消化這3個階段組成，整個過程都是在37 ℃水浴條件下進(jìn)行[16-19]。

1)模擬口腔消化階段。取一定質(zhì)量PC- MSNs，與4 mL模擬唾液(α-淀粉酶和其他鹽，pH=7)混合，將混合液的pH值調(diào)節(jié)至6.8，孵育3 min，保持250 r/min轉(zhuǎn)速水浴振蕩，以模擬口腔咀嚼過程。

2)模擬胃消化階段。將模擬口腔消化后的樣品中加入10 mL模擬胃液(3.2 mg/mL胃蛋白酶液,7 mL/L HCl以及2 g/L NaCl，pH=2)，用1 mol/L氫氧化鈉溶液將樣品pH值調(diào)整至2，孵育2 h，保持250 r/min轉(zhuǎn)速水浴振蕩，以模擬胃消化過程。

3)模擬小腸消化階段。模擬胃液消化過程結(jié)束后，立即用0.25 M氫氧化鈉溶液將消化液pH值調(diào)整至7，加入13.7 mL的模擬腸液(1.5 mg/mL胰蛋白酶液，1.5 mg/mL膽汁提取物，pH=7)。將體系pH值穩(wěn)定在7，并孵育2 h，保持250 r/min轉(zhuǎn)速水浴振蕩，以模擬小腸消化過程。

以PC消化為對照實驗，測定體系中游離PC含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSNs的表征

MSNs和PC- MSNs的氮氣吸附- 脫附等溫線見圖1。國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC)2015年的技術(shù)報告中提出了6種類型的標(biāo)準(zhǔn)物理吸附等溫線。IV型等溫線是來自介孔類吸附劑材料，介孔的吸附特性是由吸附劑- 吸附物質(zhì)的相互作用，以及在凝聚狀態(tài)下分子之間的相互作用決定的。IV(a)型等溫線的特點是在毛細(xì)管凝聚后伴隨一個小的回滯環(huán)。由圖1可知，MSNs的氮氣吸附- 脫附等溫曲線出現(xiàn)小的回滯環(huán)，呈現(xiàn)典型的IV(a)型等溫線特點，屬于介孔材料的特征曲線。

圖1 氮氣吸附- 脫附等溫線Fig.1 Nitrogen adsorption-desorption isotherm

采用BET法可得樣品的結(jié)構(gòu)參數(shù)(表1)，MSNs的孔徑為3.896 nm，比表面積為1 435 m2/g，孔容積為1.389 cm3/g，高的比表面積與孔容積為天然活性物質(zhì)的高效裝載提供可能[6]。MSNs負(fù)載藥物后，介孔特征保留，PC- MSNs的比表面積和孔體積明顯減小，從表1數(shù)據(jù)可以看出：比表面積由1 435 m2/g降到537 m2/g，孔體積由1.389 cm3/g降到0.558 cm3/g，這一結(jié)果說明PC確實被負(fù)載到MSNs顆粒的介孔孔道中。PC- MSNs比未負(fù)載的MSNs孔徑提高了約0.3 nm，可能與負(fù)載時的溫度變化有關(guān)。以PC的密度為1.705 g/cm3計算，則MSNs空腔的最大裝載量為2.368 g/g，PC- MSNs空腔的裝載量為0.952 g/g，即MSNs有60%的空間成功負(fù)載了PC。

氣溶膠法制備的MSNs顆粒的TEM圖見圖2，結(jié)果顯示MSNs顆粒呈現(xiàn)規(guī)整的球性，且具有單分散特性，直徑大小約為250～300 nm，顆粒壁厚大約20 nm，中間有明顯介孔。

表1 MSNs和PC- MSNs的結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖2 MSNs的TEM圖Fig.2 TEM images of MSNs

2.2 MSNs負(fù)載PC工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1溫度對MSNs負(fù)載PC效果的影響

按照1.2.4節(jié)的負(fù)載方法，稱取1 mg MSNs，加入1 mL 2 mg/mL PC溶液，于一定溫度處理程序下進(jìn)行負(fù)載。其中，單一溫度處理中溫度分別選擇25、30、35、40 ℃；變溫交替處理中，較高溫分別選擇25 ℃、30 ℃、35 ℃以及40 ℃。測定不同測試組PC的負(fù)載率和負(fù)載量，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，變溫交替處理的負(fù)載量和負(fù)載率均高于單一溫度處理的結(jié)果，說明溫度對于PC在溶液和硅球內(nèi)部的分配有顯著影響。另外，無論是單一溫度處理還是變溫交替處理，在30 ℃時的負(fù)載率和載藥量均最高；因此，負(fù)載過程選擇變溫交替處理程序，具體操作為30 ℃處理0.5 h，然后4 ℃處理0.5 h，此為一次變溫刺激，重復(fù)兩次，共2 h。

2.2.2PC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對MSNs負(fù)載PC效果的影響

按照1.2.4節(jié)的負(fù)載方法，稱取1 mg MSNs，將PC質(zhì)量濃度分別選取1、2、3、4 mg/mL，測定不同測試組PC的負(fù)載率和負(fù)載量，結(jié)果見圖3。

表2 溫度對負(fù)載效果的影響

同列不同字母表示差異顯著，P<0.05。

圖3 原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對負(fù)載效果的影響Fig.3 Influence of mass fraction of proanthocyanidins on loading effect

由圖3可知，隨著PC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，負(fù)載率和載藥量均隨之增大，當(dāng)PC濃度達(dá)到4.0 mg/mL時，負(fù)載量高達(dá)512 mg/g MSNs，也就是說，42%的孔體積被PC占據(jù)。若要進(jìn)一步提高負(fù)載效果，可將PC濃度進(jìn)一步提高，直至達(dá)到飽和狀態(tài)。此時，溫度處理導(dǎo)致PC從溶液進(jìn)入MSNs內(nèi)部，當(dāng)濃度為50 mg/mL時，每克MSNs對PC負(fù)載量可達(dá)566 mg，可流加PC保持溶液處于飽和狀態(tài)，提高負(fù)載量。

2.2.3處理時間對MSNs負(fù)載PC效果的影響

圖4 處理時間對負(fù)載效果的影響Fig.4 Influence of processing time on loading effect

按照1.2.4節(jié)的負(fù)載方法，稱取1 mg MSNs，溶于1 mL2 mg/mL PC溶液中，處理時間分別為0.5、1.0、1.5、2.5、3、3.5 h，測定不同測試組PC的負(fù)載率和負(fù)載量，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，較短或較長時間處理時，負(fù)載率和負(fù)載量均較低，由于初始吸附點位比較多，吸附速率較快，此階段的吸附行為可能主要發(fā)生在吸附劑的表面。隨著時間逐漸增長，PC的濃度降低和吸附劑點位的減少，吸附速率逐漸趨于平衡，當(dāng)表面的吸附點位被PC完全占據(jù)后，PC通過表面的孔隙結(jié)構(gòu)進(jìn)入到吸附劑內(nèi)的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行吸附。隨著時間進(jìn)一步增大到2.0 h后其吸附率出現(xiàn)了下降，這是因為PC出現(xiàn)了脫附現(xiàn)象[20]。在單一溫度處理時，處理總時間為2.0 h時，負(fù)載率和載藥量均最高，因此，選擇處理總時間為2.0 h。

2.2.4MSNs添加量對MSNs負(fù)載PC效果的影響

圖5 介孔二氧化硅納米顆粒添加量對負(fù)載效果的影響Fig.5 Influence of addition amount of mesoporous silica nanoparticles on loading effect

按照1.2.4節(jié)的負(fù)載方法，分別稱取1、3、4、5、7、9、11、15 mg MSNs，分別溶于 1 mL 2 mg/mL PC溶液，重復(fù)次數(shù)為2次，測定不同測試組PC的負(fù)載率和負(fù)載量，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，再MSNs添加量為1 mg時，負(fù)載率較低，但由于MSNs的量很小，導(dǎo)致計算得出負(fù)載量很高，MSNs添加量太少容易導(dǎo)致數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，故不考慮1 mg的添加量。隨MSNs用量增加到5 mg，負(fù)載率和載藥量均顯著增加，隨著吸附劑用量的增大，增加了吸附劑與PC更加充分的吸附點位，具有更大的接觸比表面積，吸附能力增強(qiáng)[16]。但當(dāng)MSNs添加量繼續(xù)增加，負(fù)載率與負(fù)載量均減少，說明MSNs過量，MSNs之間進(jìn)行PC吸附競爭，不能達(dá)到滿載。因此，最佳MSNs添加量應(yīng)為5 mg。

2.3 PC- MSNs復(fù)合體在體外模擬GIT消化體系的消化結(jié)果

以200.0 mg PC為對照，研究PC- MSNs復(fù)合體(其中PC含量為200.0 mg)在體外模擬GIT消化體系不同部位的PC含量，分析PC在消化體系中的代謝情況，見表3和圖6。

表3 模擬GIT消化體系不同部位的原花青素質(zhì)量

圖6 在模擬GIT消化體系中不同時間的原花青素含量Fig.6 Content of proanthocyanidins at different times in GIT digestion system

由表3可以看出，未經(jīng)MSNs保護(hù)的PC在胃液消化結(jié)束時損失了22.2%，在小腸結(jié)束時只剩下50.2%的PC，生物利用率較低。由于MSNs在酸性條件下穩(wěn)定[11]，PC- MSNs復(fù)合體中的PC在MSNs的保護(hù)下，在胃消化結(jié)束時僅有16.3%釋放出來；在順利到達(dá)小腸后，由于MSNs在中性條件下不穩(wěn)定，體系瓦解，大量PC在目標(biāo)小腸部位釋放出來，本實驗結(jié)果顯示，在小腸消化結(jié)束時，體系還有77.1%的PC(154.2 mg)，說明MSNs是一種理想的PC載體，可以避免其在消化過程中因在口腔和胃液中的分解而降低其在小腸部位的吸收效率，顯著提高了PC在人體內(nèi)的生物利用率[21]。

3 結(jié) 論

筆者采用氣溶膠法制得單分散的MSNs載體，具有較高的比表面積，且表面富含的硅羥基可以為PC的負(fù)載提供多個吸附位點；還是有較大的裝載量，高的孔容積，可以容納足夠多的PC分子。之后采用浸漬法用其負(fù)載生物活性物質(zhì)PC，制備PC- MSNs復(fù)合體。通過負(fù)載工藝優(yōu)化實驗探討溫度、PC質(zhì)量分?jǐn)?shù)、處理時間以及MSNs添加量對PC負(fù)載率以及負(fù)載量的影響。得出較佳負(fù)載工藝為：稱取0.005 g MSNs于離心管中，分別加入1 mL 4 mg/mL PC溶液，對其進(jìn)行變溫交替處理以促進(jìn)負(fù)載過程。30 ℃處理0.5 h，然后4 ℃處理0.5 h，重復(fù)兩次，共2小時。在此條件下，每克MSN負(fù)載量高達(dá)512 mg PC。PC和PC- MSNs復(fù)合體在體外模擬GIT體系中的消化實驗結(jié)果顯示，由于PC不耐酸，在胃中會發(fā)生降解，損失一部分，僅有約一半能到達(dá)小腸液；而PC- MSNs復(fù)合體可以避免PC在胃液破壞，順利到達(dá)其吸收部位小腸，本實驗中該規(guī)格的MSNs載體，可將大部分PC安全送到小腸，大大提高其生物利用率。通過調(diào)整制備工藝，改變MSNs孔徑和孔容積等參數(shù)，還可以進(jìn)一步調(diào)控PC在小腸內(nèi)釋放，有利于輸送更多的PC到達(dá)小腸中，為進(jìn)一步提高生物活性物質(zhì)的生物利用率提供了新的思路。