付 欣， 周 浩， 鐘 清， 祝欣然， 涂 芬， 楊 芳,*

(1.武漢工程大學(xué) 環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院/化工與制藥學(xué)院， 湖北 武漢 430205；2.海南大學(xué) 熱帶島嶼資源先進(jìn)材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 ?？?570228)

原花青素(proanthocyanidins，PC)是從植物中提取出的多酚化合物，是一種理想的天然抗氧化劑[1]，能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合防止過(guò)氧化，也可清除自由基及螯合金屬離子，還能抑制紅細(xì)胞膜過(guò)氧化，預(yù)防心腦血管等疾病[2]。原花青素可以替代化學(xué)合成的防腐劑，還可以作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，具有保護(hù)肝腎、抗衰老、降低膽固醇、紫外線防護(hù)以及抗癌等功能，因此被廣泛應(yīng)用于食品、藥品以及化妝品等領(lǐng)域。然而，由于原花青素主要在小腸被吸收，過(guò)早被口腔或胃中消化液破壞不僅會(huì)降低其在機(jī)體內(nèi)的抗氧化活性[3]，還會(huì)降低其在小腸的吸收率，從而降低生物利用率[4]。因此，可將其封裝在一個(gè)可控釋放的載體系統(tǒng)中進(jìn)行輸送，從而避免其在消化過(guò)程中因在口腔和胃液中的分解而降低其小腸吸收效率，增強(qiáng)其在腸道中的抗氧化效果[5]。2001年Vallet-Regi等首次使用介孔納米二氧化硅顆粒作為載體進(jìn)行緩釋研究以來(lái)，人們對(duì)MSNs作為藥物緩控載體進(jìn)行了深入研究[6]。MSNs具有較高的比表面積和孔體積，可調(diào)的孔徑范圍等獨(dú)特性能，可作為載體在生物活性物質(zhì)緩釋及靶向釋放的方面顯示了巨大的應(yīng)用前景[7]。有相關(guān)研究制備的空心SiO2顆粒結(jié)構(gòu)形貌良好，空腔結(jié)構(gòu)大，能從姜黃素溶液中吸附姜黃素[8]。原花青素等多酚類物質(zhì)在消化中，高濃度有利于提高其在腸細(xì)胞的生物活性[9]，將其包埋到給藥系統(tǒng)中能大幅度提高其生物利用率[10]。本研究將PC負(fù)載于MSNs中，制備PC- MSNs復(fù)合體，并研究其在模擬胃腸道(gastrointestinal tract，GIT)消化體系中的釋放，PC- MSNs復(fù)合體能耐受胃部的酸性環(huán)境，順利到達(dá)小腸釋放PC，為提高PC的生物利用率提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

甲醇(分析純)、十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)、四乙氧基硅烷(tetraethoxysilane，TEOS)、氯化銨、濃硫酸(分析純)、濃鹽酸(分析純)、胃蛋白酶(1 200 U/g)、胰蛋白酶(5×104U/g)、膽汁提取物，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品葡萄籽PC(純度≥95%)、香蘭素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。TG16- WS型離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)股份有限公司；AutosorbIQ型比表面積與孔隙度分析儀，美國(guó)康塔儀器有限公司； JEM2100型透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；TSI9302A型霧化氣溶膠發(fā)生器，美國(guó)TSI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1MSNs載體的制備

采用氣溶膠法制備MSNs[11]。稱取4.0 g CTAB，依次加入1.12 g 1 mol/L鹽酸溶液、22.8 g無(wú)水乙醇、56 g蒸餾水、10.4 g TEOS、4.0 g NH4Cl，攪拌均勻，得到前軀體溶液。將上述溶液置于霧化氣溶膠發(fā)生器中，使氣溶膠液滴生成，以氮?dú)鉃檩d體，氣溶膠液滴被干燥，并凝固在管式爐中(保持400 ℃)，得到白色顆粒。將白色顆粒在500 ℃，5小時(shí)煅燒去除CTAB和氯化銨，得到MSNs載體。

1.2.2表面特性分析

采用比表面積與孔隙率分析儀，通過(guò)測(cè)定MSNs及其PC- MSNs復(fù)合體對(duì)氮?dú)獾奈教匦詠?lái)表征其多孔性。樣品于 60 ℃下脫氣15 min，以去除吸附水，然后進(jìn)行測(cè)定，比表面積和孔體積大小根據(jù)Brunauer- Emmett- Teller (BET)方法分析[12]。

1.2.3MSNs的透射電子顯微鏡分析

采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)對(duì)MSNs的孔道結(jié)構(gòu)及孔徑進(jìn)行分析[13]，將MSNs用無(wú)水乙醇溶解后，采用超聲波進(jìn)行分散，將樣品溶液沉積到鍍有碳膜的銅網(wǎng)上，于45 ℃干燥2 h后進(jìn)行抽真空處理，在加速電壓200 kV下觀察。

1.2.4MSNs負(fù)載PC工藝優(yōu)化

采用浸漬法將PC負(fù)載于MSNs中，制備PC- MSNs。稱取一定質(zhì)量的MSNs于離心管中，分別加入1 mL PC溶液，對(duì)該體系進(jìn)行單一溫度處理或變溫交替處理以促進(jìn)負(fù)載過(guò)程。其中，單一溫度處理程序?yàn)椋悍謩e將樣品置于一定溫度處理2 h。變溫交替處理程序?yàn)椋狠^高溫處理0.5 h，然后4 ℃處理0.5 h，此為一次變溫刺激，重復(fù)兩次，共2 h。將負(fù)載后的溶液9 000 r/min離心10 min，采用硫酸- 香草醛比色法[14-15]測(cè)其上清液中的PC含量，通過(guò)PC含量計(jì)算PC負(fù)載率和負(fù)載量。

負(fù)載率=(1-Ai/A0)×100%。

(1)

負(fù)載量=負(fù)載率×ρ(原花青素)×
溶液體積/m(二氧化硅納米顆粒)。

(2)

式(1)中，Ai為上清液在500 nm處的吸光度值，A0為原花青素溶液在500 nm處的吸光度值。

1.2.5PC-MSNs的體外釋放實(shí)驗(yàn)

體外模擬GIT消化過(guò)程包括模擬口腔消化、模擬胃消化以及模擬小腸消化這3個(gè)階段組成，整個(gè)過(guò)程都是在37 ℃水浴條件下進(jìn)行[16-19]。

1)模擬口腔消化階段。取一定質(zhì)量PC- MSNs，與4 mL模擬唾液(α-淀粉酶和其他鹽，pH=7)混合，將混合液的pH值調(diào)節(jié)至6.8，孵育3 min，保持250 r/min轉(zhuǎn)速水浴振蕩，以模擬口腔咀嚼過(guò)程。

2)模擬胃消化階段。將模擬口腔消化后的樣品中加入10 mL模擬胃液(3.2 mg/mL胃蛋白酶液,7 mL/L HCl以及2 g/L NaCl，pH=2)，用1 mol/L氫氧化鈉溶液將樣品pH值調(diào)整至2，孵育2 h，保持250 r/min轉(zhuǎn)速水浴振蕩，以模擬胃消化過(guò)程。

3)模擬小腸消化階段。模擬胃液消化過(guò)程結(jié)束后，立即用0.25 M氫氧化鈉溶液將消化液pH值調(diào)整至7，加入13.7 mL的模擬腸液(1.5 mg/mL胰蛋白酶液，1.5 mg/mL膽汁提取物，pH=7)。將體系pH值穩(wěn)定在7，并孵育2 h，保持250 r/min轉(zhuǎn)速水浴振蕩，以模擬小腸消化過(guò)程。

以PC消化為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，測(cè)定體系中游離PC含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSNs的表征

MSNs和PC- MSNs的氮?dú)馕? 脫附等溫線見(jiàn)圖1。國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC)2015年的技術(shù)報(bào)告中提出了6種類型的標(biāo)準(zhǔn)物理吸附等溫線。IV型等溫線是來(lái)自介孔類吸附劑材料，介孔的吸附特性是由吸附劑- 吸附物質(zhì)的相互作用，以及在凝聚狀態(tài)下分子之間的相互作用決定的。IV(a)型等溫線的特點(diǎn)是在毛細(xì)管凝聚后伴隨一個(gè)小的回滯環(huán)。由圖1可知，MSNs的氮?dú)馕? 脫附等溫曲線出現(xiàn)小的回滯環(huán)，呈現(xiàn)典型的IV(a)型等溫線特點(diǎn)，屬于介孔材料的特征曲線。

圖1 氮?dú)馕? 脫附等溫線Fig.1 Nitrogen adsorption-desorption isotherm

采用BET法可得樣品的結(jié)構(gòu)參數(shù)(表1)，MSNs的孔徑為3.896 nm，比表面積為1 435 m2/g，孔容積為1.389 cm3/g，高的比表面積與孔容積為天然活性物質(zhì)的高效裝載提供可能[6]。MSNs負(fù)載藥物后，介孔特征保留，PC- MSNs的比表面積和孔體積明顯減小，從表1數(shù)據(jù)可以看出：比表面積由1 435 m2/g降到537 m2/g，孔體積由1.389 cm3/g降到0.558 cm3/g，這一結(jié)果說(shuō)明PC確實(shí)被負(fù)載到MSNs顆粒的介孔孔道中。PC- MSNs比未負(fù)載的MSNs孔徑提高了約0.3 nm，可能與負(fù)載時(shí)的溫度變化有關(guān)。以PC的密度為1.705 g/cm3計(jì)算，則MSNs空腔的最大裝載量為2.368 g/g，PC- MSNs空腔的裝載量為0.952 g/g，即MSNs有60%的空間成功負(fù)載了PC。

氣溶膠法制備的MSNs顆粒的TEM圖見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示MSNs顆粒呈現(xiàn)規(guī)整的球性，且具有單分散特性，直徑大小約為250～300 nm，顆粒壁厚大約20 nm，中間有明顯介孔。

表1 MSNs和PC- MSNs的結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖2 MSNs的TEM圖Fig.2 TEM images of MSNs

2.2 MSNs負(fù)載PC工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1溫度對(duì)MSNs負(fù)載PC效果的影響

按照1.2.4節(jié)的負(fù)載方法，稱取1 mg MSNs，加入1 mL 2 mg/mL PC溶液，于一定溫度處理程序下進(jìn)行負(fù)載。其中，單一溫度處理中溫度分別選擇25、30、35、40 ℃；變溫交替處理中，較高溫分別選擇25 ℃、30 ℃、35 ℃以及40 ℃。測(cè)定不同測(cè)試組PC的負(fù)載率和負(fù)載量，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可以看出，變溫交替處理的負(fù)載量和負(fù)載率均高于單一溫度處理的結(jié)果，說(shuō)明溫度對(duì)于PC在溶液和硅球內(nèi)部的分配有顯著影響。另外，無(wú)論是單一溫度處理還是變溫交替處理，在30 ℃時(shí)的負(fù)載率和載藥量均最高；因此，負(fù)載過(guò)程選擇變溫交替處理程序，具體操作為30 ℃處理0.5 h，然后4 ℃處理0.5 h，此為一次變溫刺激，重復(fù)兩次，共2 h。

2.2.2PC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)MSNs負(fù)載PC效果的影響

按照1.2.4節(jié)的負(fù)載方法，稱取1 mg MSNs，將PC質(zhì)量濃度分別選取1、2、3、4 mg/mL，測(cè)定不同測(cè)試組PC的負(fù)載率和負(fù)載量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

表2 溫度對(duì)負(fù)載效果的影響

同列不同字母表示差異顯著，P<0.05。

圖3 原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)負(fù)載效果的影響Fig.3 Influence of mass fraction of proanthocyanidins on loading effect

由圖3可知，隨著PC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，負(fù)載率和載藥量均隨之增大，當(dāng)PC濃度達(dá)到4.0 mg/mL時(shí)，負(fù)載量高達(dá)512 mg/g MSNs，也就是說(shuō)，42%的孔體積被PC占據(jù)。若要進(jìn)一步提高負(fù)載效果，可將PC濃度進(jìn)一步提高，直至達(dá)到飽和狀態(tài)。此時(shí)，溫度處理導(dǎo)致PC從溶液進(jìn)入MSNs內(nèi)部，當(dāng)濃度為50 mg/mL時(shí)，每克MSNs對(duì)PC負(fù)載量可達(dá)566 mg，可流加PC保持溶液處于飽和狀態(tài)，提高負(fù)載量。

2.2.3處理時(shí)間對(duì)MSNs負(fù)載PC效果的影響

圖4 處理時(shí)間對(duì)負(fù)載效果的影響Fig.4 Influence of processing time on loading effect

按照1.2.4節(jié)的負(fù)載方法，稱取1 mg MSNs，溶于1 mL2 mg/mL PC溶液中，處理時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.5、3、3.5 h，測(cè)定不同測(cè)試組PC的負(fù)載率和負(fù)載量，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，較短或較長(zhǎng)時(shí)間處理時(shí)，負(fù)載率和負(fù)載量均較低，由于初始吸附點(diǎn)位比較多，吸附速率較快，此階段的吸附行為可能主要發(fā)生在吸附劑的表面。隨著時(shí)間逐漸增長(zhǎng)，PC的濃度降低和吸附劑點(diǎn)位的減少，吸附速率逐漸趨于平衡，當(dāng)表面的吸附點(diǎn)位被PC完全占據(jù)后，PC通過(guò)表面的孔隙結(jié)構(gòu)進(jìn)入到吸附劑內(nèi)的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行吸附。隨著時(shí)間進(jìn)一步增大到2.0 h后其吸附率出現(xiàn)了下降，這是因?yàn)镻C出現(xiàn)了脫附現(xiàn)象[20]。在單一溫度處理時(shí)，處理總時(shí)間為2.0 h時(shí)，負(fù)載率和載藥量均最高，因此，選擇處理總時(shí)間為2.0 h。

2.2.4MSNs添加量對(duì)MSNs負(fù)載PC效果的影響

圖5 介孔二氧化硅納米顆粒添加量對(duì)負(fù)載效果的影響Fig.5 Influence of addition amount of mesoporous silica nanoparticles on loading effect

按照1.2.4節(jié)的負(fù)載方法，分別稱取1、3、4、5、7、9、11、15 mg MSNs，分別溶于 1 mL 2 mg/mL PC溶液，重復(fù)次數(shù)為2次，測(cè)定不同測(cè)試組PC的負(fù)載率和負(fù)載量，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可以看出，再M(fèi)SNs添加量為1 mg時(shí)，負(fù)載率較低，但由于MSNs的量很小，導(dǎo)致計(jì)算得出負(fù)載量很高，MSNs添加量太少容易導(dǎo)致數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，故不考慮1 mg的添加量。隨MSNs用量增加到5 mg，負(fù)載率和載藥量均顯著增加，隨著吸附劑用量的增大，增加了吸附劑與PC更加充分的吸附點(diǎn)位，具有更大的接觸比表面積，吸附能力增強(qiáng)[16]。但當(dāng)MSNs添加量繼續(xù)增加，負(fù)載率與負(fù)載量均減少，說(shuō)明MSNs過(guò)量，MSNs之間進(jìn)行PC吸附競(jìng)爭(zhēng)，不能達(dá)到滿載。因此，最佳MSNs添加量應(yīng)為5 mg。

2.3 PC- MSNs復(fù)合體在體外模擬GIT消化體系的消化結(jié)果

以200.0 mg PC為對(duì)照，研究PC- MSNs復(fù)合體(其中PC含量為200.0 mg)在體外模擬GIT消化體系不同部位的PC含量，分析PC在消化體系中的代謝情況，見(jiàn)表3和圖6。

表3 模擬GIT消化體系不同部位的原花青素質(zhì)量

圖6 在模擬GIT消化體系中不同時(shí)間的原花青素含量Fig.6 Content of proanthocyanidins at different times in GIT digestion system

由表3可以看出，未經(jīng)MSNs保護(hù)的PC在胃液消化結(jié)束時(shí)損失了22.2%，在小腸結(jié)束時(shí)只剩下50.2%的PC，生物利用率較低。由于MSNs在酸性條件下穩(wěn)定[11]，PC- MSNs復(fù)合體中的PC在MSNs的保護(hù)下，在胃消化結(jié)束時(shí)僅有16.3%釋放出來(lái)；在順利到達(dá)小腸后，由于MSNs在中性條件下不穩(wěn)定，體系瓦解，大量PC在目標(biāo)小腸部位釋放出來(lái)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在小腸消化結(jié)束時(shí)，體系還有77.1%的PC(154.2 mg)，說(shuō)明MSNs是一種理想的PC載體，可以避免其在消化過(guò)程中因在口腔和胃液中的分解而降低其在小腸部位的吸收效率，顯著提高了PC在人體內(nèi)的生物利用率[21]。

3 結(jié) 論

筆者采用氣溶膠法制得單分散的MSNs載體，具有較高的比表面積，且表面富含的硅羥基可以為PC的負(fù)載提供多個(gè)吸附位點(diǎn)；還是有較大的裝載量，高的孔容積，可以容納足夠多的PC分子。之后采用浸漬法用其負(fù)載生物活性物質(zhì)PC，制備PC- MSNs復(fù)合體。通過(guò)負(fù)載工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)探討溫度、PC質(zhì)量分?jǐn)?shù)、處理時(shí)間以及MSNs添加量對(duì)PC負(fù)載率以及負(fù)載量的影響。得出較佳負(fù)載工藝為：稱取0.005 g MSNs于離心管中，分別加入1 mL 4 mg/mL PC溶液，對(duì)其進(jìn)行變溫交替處理以促進(jìn)負(fù)載過(guò)程。30 ℃處理0.5 h，然后4 ℃處理0.5 h，重復(fù)兩次，共2小時(shí)。在此條件下，每克MSN負(fù)載量高達(dá)512 mg PC。PC和PC- MSNs復(fù)合體在體外模擬GIT體系中的消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由于PC不耐酸，在胃中會(huì)發(fā)生降解，損失一部分，僅有約一半能到達(dá)小腸液；而PC- MSNs復(fù)合體可以避免PC在胃液破壞，順利到達(dá)其吸收部位小腸，本實(shí)驗(yàn)中該規(guī)格的MSNs載體，可將大部分PC安全送到小腸，大大提高其生物利用率。通過(guò)調(diào)整制備工藝，改變MSNs孔徑和孔容積等參數(shù)，還可以進(jìn)一步調(diào)控PC在小腸內(nèi)釋放，有利于輸送更多的PC到達(dá)小腸中，為進(jìn)一步提高生物活性物質(zhì)的生物利用率提供了新的思路。