沈陽市第六人民醫(yī)院 （遼寧 沈陽 110006）

內(nèi)容提要： 目的：研究測(cè)序儀對(duì)乙型肝炎病毒耐藥突變基因的檢測(cè)結(jié)果。方法：從2017年1月～2018年12月，本院收治的患者中選擇連續(xù)服用拉米夫定、阿德福韋酯等核苷酸類藥物2年以上，臨床表現(xiàn)為病毒學(xué)突破，且HBVDNA＞3×103IU/mL的慢乙肝患者中選取104例參與研究，進(jìn)行乙肝病毒突變基因檢測(cè)，分析突變位點(diǎn)，并對(duì)病毒進(jìn)行基因分型。結(jié)果：研究組患者的104例慢性乙型肝炎血清當(dāng)中，使用測(cè)序法進(jìn)行檢驗(yàn)有B型和C型兩種基因型。兩種基因型數(shù)量分別為11例和93例，所占比重分別為10.58%和89.42%。測(cè)序法能夠檢出12個(gè)突變位點(diǎn)，主要耐藥的藥物為拉米夫定。結(jié)論：測(cè)序儀能夠很好的檢驗(yàn)乙型肝炎病毒耐藥突變基因。

我國(guó)是肝病大國(guó)，乙型肝炎病毒（HBV）引發(fā)乙型肝炎是我國(guó)肝病的主要原因，乙肝疾病是一種傳染性疾病，受到乙肝病毒的影響，疾病分布會(huì)出現(xiàn)顯著的地域性特征。根據(jù)乙型肝炎病毒的全基因序列進(jìn)行劃分，可以分為A-I等多種不同類型的基因型[1]。目前我們國(guó)家的乙肝病毒主要以B、C型為主，此外部分地區(qū)還有少量D型。通常乙肝病毒采用核苷類似物進(jìn)行治療，由于早期的拉米夫定很容易使乙肝病毒產(chǎn)生耐藥突變，所以對(duì)乙肝病毒耐藥突變的檢測(cè)可以為臨床的治療提供可靠的依據(jù)。目前主要采用一代測(cè)序和焦磷酸測(cè)序方法等對(duì)乙肝病毒耐藥突變基因進(jìn)行檢測(cè)。常用的PCR法由于所涉及的位點(diǎn)較多，很難實(shí)現(xiàn)耐藥突變檢測(cè)。本文主要采用了測(cè)序法進(jìn)行研究，判斷測(cè)序儀對(duì)乙型肝炎病毒耐藥突變基因的檢測(cè)有效性，具體如下。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

從2017年1月～2018年12月，本院收治的患者中，連續(xù)服用拉米夫定、阿德福韋酯等核苷酸類藥物2年以上的患者中，選擇臨床表現(xiàn)為病毒學(xué)突破，且HBV-DNA＞3×103IU/mL的104例慢性乙肝患者參與研究。男性68例，女性36例。年齡20～69歲，平均（40.17±0.28）歲。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

①測(cè)序用電泳緩沖液、POP5電泳凝膠、Big Dye均購(gòu)自美國(guó)Abi公司；②PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自寶生物（大連）有限公司生產(chǎn)；③HBV病毒核酸提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司生產(chǎn)的病毒提取試劑盒QIAamp Viral DNA Mini Kit。

1.2.2 軟件和儀器

使用VectorNTI 7.1分子生物學(xué)分析軟件設(shè)計(jì)引物。臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)為THERMO。測(cè)序儀為ABi 3130基因測(cè)序儀。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

①使用QIAamp Viral DNA Mini Kit試劑盒提取出乙肝病毒DNA；②HBV耐藥檢測(cè)及基因分型根據(jù)HBV-DNA的P區(qū)基因設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)好的引物由上海生工合成。使用雙脫氧鏈終止法聯(lián)合熒光標(biāo)記檢測(cè)方法，操作的步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。使用熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，將HBVP區(qū)序列擴(kuò)增，并根據(jù)熒光反應(yīng)曲線的方法，對(duì)增長(zhǎng)的情況進(jìn)行判定。在此環(huán)節(jié)中，可以將5μL的產(chǎn)物加入到2μL的堿性磷酸酶溶液當(dāng)中進(jìn)行混合[2]；③測(cè)序反應(yīng)體系為：使用PCR酶解產(chǎn)物3μL、測(cè)序反應(yīng)液1μL、測(cè)序引物2μL。反應(yīng)的溫度條件控制為1min 96°C；96°C 10S→50°C 5S→60°C 4min，循環(huán)25次。④全程提供實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照研究[3]。

1.3 結(jié)果分析

將實(shí)驗(yàn)操作得出的序列圖使用Chromas 2軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，并與美國(guó)國(guó)立圖書館的中心基因圖庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)乙肝病毒基因進(jìn)行對(duì)比分析，得出基因突變情況的結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS24.0。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 HBV基因分型結(jié)果分析

使用測(cè)序法進(jìn)行檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)104例樣本中只有B型和C型兩種基因型。兩種基因型數(shù)量分別為11例和93例，所占比重分別為10.58%和89.42%。

2.2 測(cè)序儀檢測(cè)結(jié)果分析

經(jīng)過測(cè)序儀檢驗(yàn)得出，104例慢性乙型肝炎患者的血清當(dāng)中，有96例檢測(cè)出突變，突變檢測(cè)率為92.3%。檢出耐藥位點(diǎn)12個(gè)，分別為V173L、V173M、L180M、A181T、A181V、M204I、M204V、M207I、S202I、N236T、M250V、M250R。主要為拉米夫定相關(guān)耐藥突變位點(diǎn)。多重耐藥26例，占比27.08%

2.3 兩大核苷類似物藥物耐藥檢測(cè)結(jié)果分析

核苷類藥兩大陣營(yíng)核苷與核苷酸，核苷類拉米夫定、替比夫定和恩替卡韋耐藥72例，核苷酸阿德福韋酯耐藥24例，兩者無顯著差異。

3.討論

乙肝病毒的DNA分子當(dāng)中，有一部分為環(huán)狀的雙鏈分子。該部分的病毒分子，會(huì)在患者體內(nèi)復(fù)制活躍，在體內(nèi)呈指數(shù)級(jí)復(fù)制。當(dāng)有乙肝病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏明顯的聚合酶矯正功能的情況下，錯(cuò)配率變成萬分之一的概率，引起大量的突變情況，突變會(huì)進(jìn)入到基因組的編碼區(qū)。通過本文的研究工作可以看出，臨床上使用的抗病毒治療藥物在長(zhǎng)期使用中，病毒會(huì)產(chǎn)生抗藥性，引發(fā)基因突變。準(zhǔn)種進(jìn)化與藥物壓力選擇的共同作用下，會(huì)加劇此種基因突變情況。在沒有經(jīng)過藥物壓力篩選的作用下，基因突變會(huì)隨機(jī)產(chǎn)生多種不同類型的劣勢(shì)準(zhǔn)種，受到抗病毒藥物的作用，會(huì)在患者體內(nèi)逐步發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種[4]。臨床上，測(cè)序儀測(cè)序方法，可以獲得HBV的基因型，為臨床的治療工作提供充足的依據(jù)[5]。但是，在與核苷酸類藥物治療中獲取的HBV耐藥變異沒有明顯的關(guān)聯(lián)性。我國(guó)大部分地區(qū)流行的乙型肝炎病毒基因型主要包括了ABCD四種不同的類型，其中B型和C型所占的比重較大，二者合計(jì)超過了95%以上。北方城市主要以C型為主，南方城市主要以B型為主，本次研究中C型占比達(dá)到89.42，結(jié)果較為符合。

抗病毒治療是慢性乙型肝炎病毒治療工作中的重要部分，結(jié)合本文的研究成果與相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者的論述可以看出，本文提出的測(cè)定理論無論是在理論上還是在實(shí)踐上都有明顯的優(yōu)勢(shì)，測(cè)序儀測(cè)定結(jié)果具有較高的參考價(jià)值。除此之外，在對(duì)乙型肝炎病毒耐藥突變基因進(jìn)行檢驗(yàn)中，還可從RAAS的促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用方面著手。炎癥能刺進(jìn)抑制因素的生長(zhǎng)，進(jìn)而提高檢出率。核苷酸類藥物在應(yīng)用中有利于證明未腎素、AngII表達(dá)水平的升高與降低和患者長(zhǎng)期服用抗慢性肝炎有關(guān)聯(lián)。根據(jù)研究得出，核苷酸類藥物主要是通過與HBV pol天然底物dNTP競(jìng)爭(zhēng)的方式，獲取抑制HBV pol的活性，進(jìn)而產(chǎn)生抑制病毒復(fù)制的效果。從目前已知的核苷酸類藥物治療工作中可以看出，耐藥突變主要發(fā)生在HBV pol當(dāng)中。長(zhǎng)期使用核苷酸類藥物，病毒會(huì)發(fā)生變異情況，病毒基因序列當(dāng)中的有效靶位出現(xiàn)了變化，病毒基因耐藥性因此發(fā)生突變。本文在研究工作中，測(cè)序儀測(cè)序法進(jìn)行檢驗(yàn)，根據(jù)檢驗(yàn)得出的結(jié)果可以看出，對(duì)于已知位點(diǎn)的耐藥性變異情況進(jìn)行檢驗(yàn)，測(cè)序儀測(cè)序法有較高的檢出率。根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域工作人員的檢驗(yàn)工作結(jié)果可以判斷，臨床上使用此種方法進(jìn)行研究和檢測(cè)，所得出的有效性更為顯著。

綜上所述，測(cè)序儀檢驗(yàn)乙型肝炎病毒耐藥突變基因有較高的檢出率。