蔣艾廷， 李寶坤， 金 丹， 喬傳麗， 楊 婕， 趙利利

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832000）

乳酸菌（lactic acid bacteria）是一類能夠發(fā)酵乳糖生成乳酸的革蘭氏陽性益生菌，對人體健康起著至關(guān)重要的作用[1]。 通常人們通過食用含活菌制品或含菌體組分及代謝產(chǎn)物的死菌制品來維持人體腸道內(nèi)的菌群平衡，發(fā)酵乳制品因其豐富的營養(yǎng)價(jià)值與益生作用受到許多消費(fèi)者的青睞[2-4]，發(fā)酵劑中乳酸菌的細(xì)胞活力與細(xì)胞數(shù)量是影響發(fā)酵食品質(zhì)量的關(guān)鍵因素[5]。 目前，乳酸菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)方式主要為冷凍干燥和噴霧干燥[6]。 噴霧干燥是在干燥室利用熱空氣，將進(jìn)料溶液霧化，去除水蒸氣得到干粉物質(zhì)。 與冷凍干燥相比，噴霧干燥設(shè)備投入低、操作簡單、容易擴(kuò)大規(guī)模和連續(xù)生產(chǎn)[7-10]。 但是，高溫、干燥、氧化等環(huán)境使菌體遭受到嚴(yán)重的損傷或大量死亡[11-13]。 多年以來，國內(nèi)外針對噴霧干燥導(dǎo)致乳酸菌活力低下的問題，開展了大量的研究工作。 在乳酸菌噴霧干燥方面，深入研究乳酸菌在噴霧干燥過程中的微生物學(xué)性質(zhì)與存活機(jī)理， 結(jié)合添加保護(hù)劑、乳酸菌收獲階段、脅迫處理和噴霧干燥工藝參數(shù)選擇等多種手段，提高乳酸菌的活力一直是乳酸菌噴霧干燥研究的重點(diǎn)[14-16]。

目前，我國商業(yè)化發(fā)酵劑生產(chǎn)廠家較少，發(fā)酵劑市場被國外公司壟斷。 作者以德氏乳桿菌（lactobacillus delbrueckii）ATx（KY310724）為研究對象，檢測細(xì)胞的亞致死溫度以及分析在噴霧干燥過程中保護(hù)劑對細(xì)胞存活率、細(xì)胞膜ATP 酶、糖代謝關(guān)鍵酶和產(chǎn)酸性能的影響，為乳酸菌噴霧干燥提供理論支持，促進(jìn)我國發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株： 德氏乳桿菌（lactobacillus delbrueckii）ATx（KY310724），從新疆塔城地區(qū)傳統(tǒng)酸奶中分離，由石河子大學(xué)食品學(xué)院保存。

MRS 肉湯：青島海博生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：美國Amresco 公司；己糖激酶（HK）、Ca2+Mg2+、Na+K+、總ATP 酶試劑盒：南京建成生物公司；乳酸脫氫酶試劑盒（LDH）：北京索萊寶科技有限公司；保護(hù)劑：20%脫脂乳（SM）、12%脫脂乳+8%菊糖（SMS）、12%脫脂乳+8%海藻糖（SMT）、12%脫脂乳+4%菊糖+4%海藻糖（SMST），105 ℃滅菌20 min。

1.2 主要儀器設(shè)備

VCX500 型超聲波細(xì)胞破碎儀： 美國Sonics 公司；SD-100 型噴霧干燥機(jī)：日本EYELA（東京理化）東京理化器械株式會社；Neoluge 15R 型臺式高速冷凍離心機(jī)：香港力康發(fā)展有限公司；752 型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱： 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-30KBS 型電熱蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D 型超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞前處理乳酸脫氫酶（LDH）的測定：收集乳酸菌細(xì)胞到5 mL 離心管（8 000 r，4 ℃，10 min），倒掉上清液， 加入5 mL 提取液， 冰水浴超聲破碎（功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30 次），在4 ℃下8 000 r 離心10 min，取上清液，置于冰上待測；己糖激酶（HK）的測定：取5mL 菌液在室溫下，1 000 r/min離心10 min，倒掉上清液用PBS 緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）洗滌2 次后重懸，進(jìn)行超聲破碎（功率300 W，每次3~5 s，間隔4 次，間隔30 s，冰水浴）；細(xì)胞ATP酶的測定：取5 mL 菌液離心（2 500 r，10 min）棄上清液，留下層細(xì)胞，用PBS 緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.86）重懸超聲，條件同上，破碎好的細(xì)胞懸浮液直接用于以上酶活的檢測。

1.3.2 熱處理將培養(yǎng)至對數(shù)末期（16~18 h）的德氏乳桿菌濃縮富集至11 lg CFU/mL 左右，離心（4 ℃，6 000 r，10 min）， 用pH 6.86 的PBS 緩沖液洗滌2次，在相同的條件下離心重懸。 將細(xì)胞用漩渦混勻儀混勻， 分別置于46、50、54、58 ℃處理3、6、9、12、15 min，以未經(jīng)過熱處理的細(xì)胞作為對照，測定其細(xì)胞活菌數(shù)的變化。

1.3.3 噴霧干燥將50 mL 已配好的保護(hù)劑加入經(jīng)過熱處理后離心的菌泥中， 同時(shí)以添加50 mL PBS 作為對照，進(jìn)行噴霧干燥。 噴霧干燥條件為：入口溫度150 ℃；出口溫度70～74 ℃；進(jìn)料流量300 mL/h；熱空氣流量0.5 m3/h；噴霧壓力15×10 kPa。

1.3.4 蛋白質(zhì)的測定采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)[17]。

1.3.5 酶活與細(xì)胞可培養(yǎng)性的測定己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、乳酸脫氫酶（LDH）的測定： 采用北京索萊寶科技有限公司的相應(yīng)試劑盒；可培養(yǎng)性的測定： 通過將經(jīng)過噴霧干燥的菌粉，重新溶解于相同體積的PBS 緩沖液中，采用菌落平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Oringin 2016 軟件作圖， 利用Minitab 16 軟件中的Fisher 單因子多重比較對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，置信水平為95%，“*”或不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱脅迫對細(xì)胞可培養(yǎng)性的影響

收集對數(shù)末期的菌體， 重懸于PBS 緩沖液中，通過不同溫度熱處理后，以未經(jīng)熱處理的菌體作為對照，結(jié)果見圖1。當(dāng)熱脅迫溫度低于50 ℃時(shí)，德氏乳桿菌的活菌數(shù)隨著溫度的逐漸升高變化不明顯；當(dāng)熱處理溫度高于50 ℃時(shí)， 德氏乳桿菌的活菌數(shù)隨著溫度的升高顯著下降。 當(dāng)?shù)率先闂U菌在46 ℃脅迫0～15 min 時(shí)， 活菌數(shù)僅下降0.08 lg CFU/mL，幾乎未發(fā)生死亡。 當(dāng)?shù)率先闂U菌在50 ℃脅迫0～15 min 時(shí)，活菌數(shù)下降0.107 lg CFU/mL，與未經(jīng)熱脅迫的對照相比，差異不顯著。 當(dāng)?shù)率先闂U菌在54 ℃處理時(shí)，從第3～15 分鐘開始，活菌數(shù)均顯著地下降（P＜0.05），活菌數(shù)從10.57 lg CFU/mL 下降至8.58 lg CFU/mL，降低了1.99 lg CFU/mL。 當(dāng)熱脅迫溫度為58 ℃時(shí)，德氏乳桿菌大量的死亡，熱脅迫3 min 時(shí)，活菌數(shù)從10.55 lg CFU/mL 下降為8.60 lg CFU/mL，隨后依次顯著的下降（P＜0.05），當(dāng)熱脅迫時(shí)間為15 min 時(shí)，德氏乳桿菌的活菌數(shù)僅為5.62 lg CFU/mL，降低了4.93 lg CFU/mL。

研究[18]發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的最適生長溫度集中在30～37 ℃， 噴霧干燥過程中的過高的溫度導(dǎo)致菌體細(xì)胞大量脫水、細(xì)胞膜受到損害，從而造成菌體失活[19]。 自然狀態(tài)下的大多數(shù)微生物在生長過程中均受到各種脅迫環(huán)境的影響，微生物在各種脅迫環(huán)境下具有自我調(diào)控能力，并通過各種生理反應(yīng)來適應(yīng)不利環(huán)境[20]。 乳酸菌在高溫條件下通常會發(fā)生熱應(yīng)激。 熱應(yīng)激是生物在高于正常生理溫度環(huán)境下抵御高溫環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)[21]。目前，通過熱脅迫來提高乳酸菌在噴霧干燥中的活菌數(shù)是常用的技術(shù)手段之一。 乳酸菌受到熱脅迫后可以調(diào)控自身的防御系統(tǒng)來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)和代謝途徑，產(chǎn)生一系列熱激蛋白以降低或消除熱脅迫的傷害。Lavari[22]發(fā)現(xiàn)溫和的熱脅迫能夠有效的減少乳酸菌在噴霧干燥中的死亡，Desmond[23]發(fā)現(xiàn)采用亞致死溫度進(jìn)行熱脅迫能夠提高乳酸菌對高溫的耐受性。 因此作者選擇46～58 ℃作為熱脅迫的溫度，發(fā)現(xiàn)乳酸菌經(jīng)50 ℃脅迫15 min 后，活菌數(shù)未發(fā)生明顯變化（P≥0.05），選擇其作為熱脅迫的條件，這與Zhang Yun 等[24]的研究結(jié)果相同。

2.2 保護(hù)劑對細(xì)胞可培養(yǎng)性的影響

噴霧干燥是一個劇烈的、 綜合的脅迫過程，涉及到脫水干燥、高滲脅迫、高溫脅迫等，導(dǎo)致菌體的活菌數(shù)降低。 在發(fā)酵劑的制備過程中，保護(hù)劑對生物體或生物大分子具有良好的非特異性保護(hù)作用，能有效提高噴霧干燥過程中乳酸菌的活菌數(shù)[25]。 采用20 g/dL 脫脂乳、12 g/dL 脫脂乳+8 g/dL 菊糖、12 g/dL脫脂乳+ 8 g/dL 海藻糖及12 g/dL 脫脂乳+4 g/dL 菊糖+4 g/dL 海藻糖作為保護(hù)劑，與不加護(hù)劑的菌體為對照，進(jìn)行噴霧干燥。 由圖2 可以看出，添加保護(hù)劑能夠有效提高德氏乳桿菌的細(xì)胞活菌數(shù)，不同的保護(hù)劑對德氏乳桿菌的保護(hù)效果是有差異的。 未添加保護(hù)劑的菌液經(jīng)過噴霧干燥后的活菌數(shù)明顯的降低（P＜0.05），降低了2.29 lg CFU/mL，SMS 對德氏乳桿菌的保護(hù)效果最好，經(jīng)過噴霧干燥后，活菌數(shù)降低較小，與對照組相比，無明顯差異。 其次對德氏乳桿菌保護(hù)較好的是SMST 與SMT，經(jīng)過噴霧干燥后活菌數(shù)分別降低了0.21 lg CFU/mL 與0.36 lg CFU/mL，與對照組相比具有顯著差異（P＜0.05）。SM 對的德氏乳桿菌的保護(hù)效果相對弱于前三種， 經(jīng)噴霧干燥后，活菌數(shù)下降了0.92 lg CFU/mL。

圖2 保護(hù)劑對細(xì)胞可培養(yǎng)性的影響Fig. 2 Influence of protective agent on cell culturability

研究表明，脫脂乳粉是制備發(fā)酵劑時(shí)運(yùn)用最廣泛的保護(hù)劑之一[26]，其中的乳糖和乳清蛋白能對菌種產(chǎn)生較好的保護(hù)作用，通常以“包埋”的形式將菌體與外界不利環(huán)境隔離，減少因細(xì)胞壁損傷而引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，起到保護(hù)菌體的作用。 此外，一些糖類物質(zhì)也能夠提高干燥過程中菌體細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而提高細(xì)胞的活力[27]。以功能性低聚糖作為益生菌的保護(hù)劑能夠促進(jìn)動物機(jī)體健康和調(diào)節(jié)腸道微生物體系平衡等保健作用[28]。 本研究選取的四種保護(hù)劑均能夠提高乳酸菌在噴霧干燥過程中細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減少高溫、脫水等不利環(huán)境對細(xì)胞膜的損傷，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。

2.3 保護(hù)劑對細(xì)胞己糖激酶與乳酸脫氫酶的影響

己糖激酶（HK）與乳酸脫氫酶（LDH）是糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，廣泛的存在于各種動物、植物、微生物與培養(yǎng)細(xì)胞中，己糖激酶是糖代謝途徑中的第一個酶，其活性大小與糖代謝速率相關(guān)，乳酸脫氫酶是糖代謝途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)， 其活性大小與微生物的產(chǎn)酸能力有關(guān)。 作者測定保護(hù)劑對德氏乳桿菌噴霧干燥菌粉的己糖激酶與乳酸脫氫酶活力的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 保護(hù)劑對細(xì)胞己糖激酶與乳酸脫氫酶的影響Fig. 3 Influence of protective agent on cell hexokinase and lactate dehydrogenase

由圖3 可以看出，保護(hù)劑對德氏乳桿菌乳酸脫氫酶活力的影響為：SMS＞SMST ＞SMT ＞SM＞PBS。對己糖激酶活力的影響為：SMS＞SMST＞SMT＞SM＞PBS。經(jīng)過PBS 處理的菌液噴霧干燥后，乳酸脫氫酶與己糖激酶的活力分別由6.039 4 U/mg 與8.137 8 U/g 下降為1.524 9 U/mg 與2.454 6 U/g， 大約降低了4 倍。通過添加SMS 的德氏乳桿菌乳酸脫氫酶與己糖激酶活力分別由6.039 4 U/mg 與8.137 8 U/g下降為4.967 5 U/mg 與6.971 6 U/g，下降了1.21 與1.17 倍， 其余三種保護(hù)劑的保護(hù)效果均弱于SMS。經(jīng)過噴霧干燥后，已糖激酶與乳酸脫氫酶的活性均有不同程度的下降。 但也可以看出，未添加保護(hù)劑的噴霧干燥菌粉的兩種酶，活力最低，說明保護(hù)劑能夠減小己糖激酶與乳酸脫氫酶活力的損失。 此外，保護(hù)劑的成分對酶活的損失也有一定的影響。

2.4 保護(hù)劑對細(xì)胞Ca2+Mg2+、Na+K+與總ATP 酶的影響

ATP 酶廣泛存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，是生物膜上的一種蛋白酶，它在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換以及信息遺傳方面具有重要的作用，細(xì)胞在缺氧或者一些其他脅迫狀態(tài)下， 此酶活力會發(fā)生改變。作者測定保護(hù)劑對德氏乳桿菌噴霧干燥菌粉的Ca2+Mg2+、Na+K+與總ATP 酶活力的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4 可知， 在噴霧干燥過程中SM、SMS、SMT、SMST 能夠?qū)Φ率先闂U菌提供一定的保護(hù)效果。 添加四種保護(hù)劑的乳酸菌經(jīng)過噴霧干燥后細(xì)胞膜的Ca2+Mg2-ATPase 與Na+K+-ATPase 活力均明顯（P＜0.05）高于PBS 組，但四種保護(hù)劑之間無明顯差異。 添加四種保護(hù)劑的乳酸菌經(jīng)過噴霧干燥后細(xì)胞膜的總ATP 酶活力也均高于PBS 組（P＜0.05），但四種保護(hù)劑對總ATP 酶活力的影響有顯著的差異，其中，SMS 對細(xì)胞膜總ATP 酶活力影響最大，與噴霧前的菌體酶活相比，僅下降了0.059 53 U/mg，與對PBS組相比，酶活提高了0.206 07 U/mg。 SM 與SMST 對細(xì)胞膜總ATP 酶的影響差異不明顯， 與噴霧前的菌體酶活相比分別下降了0.144 43、0.134 07 U/mg，與對PBS 組相比， 酶活分別提高了0.121 17、0.131 53 U/mg。SMT 對細(xì)胞膜總ATP 酶活力的保護(hù)效果明顯弱于（P＜0.05）前三種保護(hù)劑，但與PBS 組相比也具有明顯（P＜0.05）的效果。

圖4 保護(hù)劑對細(xì)胞膜ATP 酶的影響Fig. 4 Influence of protective agent on cell membrane ATPase

2.5 保護(hù)劑對乳酸菌產(chǎn)酸性能的影響

在發(fā)酵乳制品的加工與制造的過程中，乳酸菌能將原料乳中的乳糖分解成葡萄糖與半乳糖，葡萄糖進(jìn)一步分解成乳酸， 使pH 逐漸降低達(dá)到酪蛋白的等電點(diǎn)4.6 左右時(shí)，牛乳開始凝固。乳酸菌的產(chǎn)酸特性能夠直接關(guān)系到產(chǎn)品的最終質(zhì)量，本研究測定了在42 ℃的條件下經(jīng)不同保護(hù)劑處理的德氏乳桿菌在12%的脫脂乳中的產(chǎn)酸情況，見圖5。

由圖5 可知，經(jīng)過四種保護(hù)劑處理的德氏乳桿菌在12 g/dL 的脫脂乳中生長良好， 經(jīng)過發(fā)酵16 h后，脫脂乳的pH 值由6.37 下降至4.0 以下，凝乳時(shí)間在8～10 h 之間。 在0～2 h 時(shí)，脫脂乳的pH 幾乎未發(fā)生改變，pH 值僅下降0.08； 發(fā)酵2 h 后脫脂乳的pH 開始逐漸的下降，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為4～6 h 時(shí)，脫脂乳pH 下降的速率最大；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間至8 h 時(shí)，脫脂乳開始凝固，凝乳時(shí)間：SMS＜SMST＜SMT＜SM。 隨后脫脂乳的pH 下降速率逐漸變緩，發(fā)酵16 h 后脫脂乳的pH 基本不再改變。

圖5 保護(hù)劑對乳酸菌產(chǎn)酸性能的影響Fig. 5 Influence of protective agent on acid-producing?ability of lactic acid bacteria

3 結(jié) 語

在噴霧干燥過程中，不同保護(hù)劑對德氏乳桿菌ATx 的保護(hù)效果不同， 四種保護(hù)劑對噴霧干燥活菌數(shù)的保護(hù)效果為：SMS＞SMST＞SMT＞SM， 說明SMS可以有效降低（P＜0.05）德氏乳桿菌ATx 的死亡。 也可以看出，在12 g/dL 脫脂乳的基礎(chǔ)上，8 g/dL 菊糖的保護(hù)效果優(yōu)于8 g/dL 海藻糖。 同時(shí)測定了噴霧干燥對細(xì)胞膜ATP 酶活力的影響，四種保護(hù)劑對細(xì)胞膜ATP 酶的保護(hù)效果均為：SMS＞SMST＞SMT＞SM。與其它三種保護(hù)劑相比，SMS 能夠有效的保護(hù)細(xì)胞膜，提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，同時(shí)也說明噴霧干燥中德氏乳桿菌細(xì)胞的死亡與細(xì)胞膜ATP 酶有密切的關(guān)系。 四種噴霧干燥菌粉在脫脂乳中均能正常生長，凝乳時(shí)間為8～10 h。 由于真空冷凍干燥制備乳酸菌發(fā)酵劑價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜[29]，而噴霧干燥具有低成本、產(chǎn)品保存時(shí)間長、運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)[30]，因此利用噴霧干燥制備乳酸菌發(fā)酵劑很有前景。 本研究為乳酸菌的噴霧干燥技術(shù)提供理論支持，但針對乳酸菌噴霧干燥的工藝與發(fā)酵劑貯藏條件還需要后續(xù)深入研究。