李芳良， 何洪剛， 馬 玉， 毛忠貴， 陳旭升*

（1. 江南大學(xué) 工業(yè)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無(wú)錫214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫214122）

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡(jiǎn)寫ε-PL）是以25~35 個(gè)L-賴氨酸為惟一單體聚合而成的一種同型氨基酸聚合物， 相對(duì)分子質(zhì)量一般為3 200~4 500。它具有水溶性好、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、抑菌譜廣和生物安全性高等特點(diǎn)，從而成為一種優(yōu)良的生物食品防腐劑，被廣泛應(yīng)用于日本、韓國(guó)、歐美等國(guó)家食品工業(yè)中[1]。 2014 年，我國(guó)衛(wèi)計(jì)委將ε-PL 及其鹽酸鹽批準(zhǔn)成為我國(guó)新型食品防腐劑并被納入到國(guó)標(biāo)GB2760-2014[2]。此外，ε-PL 還在醫(yī)藥、電子、材料等方面有著非常廣泛的應(yīng)用[3]。

微生物發(fā)酵法是目前大量獲得ε-PL 的惟一生產(chǎn)方法。 然而，發(fā)酵液成分復(fù)雜，除了含有大量菌體細(xì)胞和未被消耗的培養(yǎng)基成分， 還含有菌體裂解物、代謝副產(chǎn)物、色素和膠體等。 作者所在研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單固液分離后，ε-PL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為20%左右[4]。 但是作為食品添加劑，GB2760-2014 要求ε-PL 及其鹽酸鹽的純度至少在質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%以上[2]。 因此，如何從復(fù)雜的發(fā)酵液體系中低成本、 高效率地分離純化ε-PL 及其鹽酸鹽就成為限制ε-PL 產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。 目前，離子交換法被普遍應(yīng)用于ε-PL 的分離提取[5-7]，它具有除雜能力強(qiáng)、產(chǎn)品回收率高等優(yōu)勢(shì)，是一種非常有效的提取方法。 但是， 用于離子交換解吸附的洗脫劑主要是0.1~0.2 mol/L 鹽酸、氫氧化鈉或氨水，這就為后續(xù)ε-PL 精制步驟引入了大量的鹽分（主要是酸堿中和反應(yīng)產(chǎn)生的NaCl）。 然而，目前關(guān)于如何去除ε-PL 提取過(guò)程中的鹽分卻很少被報(bào)道。 周斌等[8]利用截留相對(duì)分子質(zhì)量為4 000 的超濾膜對(duì)脫色后的洗脫液進(jìn)行濃縮和脫鹽，但并未給出此步驟的脫鹽效率和產(chǎn)品回收率等指標(biāo)。

作者所在研究團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)對(duì)發(fā)酵液中雜蛋白質(zhì)去除方法[9]、脫色方法[10]、離子交換樹(shù)脂選型[5]等方面的研究，提出了一種從發(fā)酵液中分離提取ε-PL的方法[11]。 但是該工藝所用的截留相對(duì)分子質(zhì)量為1 000 納濾膜為板式膜， 而工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的多為性價(jià)比更高的卷式膜，因此有必要篩選出合適的卷式膜來(lái)進(jìn)行ε-PL 離子交換提取液的脫鹽研究。

納濾（Nanofiltration）是介于反滲透和超濾之間的一種膜分離技術(shù)，它是基于道南效應(yīng)（電荷）和篩分（孔徑）原理，用于低相對(duì)分子質(zhì)量產(chǎn)物濃縮和脫鹽，被廣泛應(yīng)用于水處理、食品加工[12]和生物分離[13]等行業(yè)。 作者以ε-PL 和NaCl 制成的模擬料液為研究對(duì)象，通過(guò)納濾膜篩選、操作方式和操作條件優(yōu)化， 確定了適合ε-PL 料液脫鹽的納濾膜和操作條件，并考察了納濾膜應(yīng)用于真實(shí)物料（離交洗脫液）情況下的脫鹽效果。該研究是首次嘗試納濾用于ε-PL 分離和提取過(guò)程的脫鹽，對(duì)ε-PL 產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)選用的納濾膜元件均為卷式膜，相關(guān)技術(shù)參數(shù)見(jiàn)表1。ε-PL 購(gòu)買于鄭州拜納佛生物工程有限公司， 該樣品的ε-PL 純度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%。 NaCl和膜清洗用亞硫酸氫鈉為分析純，購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 膜性質(zhì)Table 1 Membrane properties

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

膜分離系統(tǒng)由安徽普朗膜技術(shù)有限公司提供，型號(hào)為PL-D3-1812，見(jiàn)圖1。 三種納濾膜面積均為0.27 m2，操作溫度控制在（25.0±1.0） ℃并由循環(huán)水實(shí)現(xiàn)。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)控制循環(huán)液節(jié)流閥，保持進(jìn)口壓力恒定在1.0 MPa。 循環(huán)液流量和滲透通量通過(guò)轉(zhuǎn)子流量計(jì)讀取。電導(dǎo)率儀DDSJ-308A（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）和pH 計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）分別用于透過(guò)液電導(dǎo)率和料液pH 值的測(cè)定。

圖1 PL-D3-1812 膜分離系統(tǒng)設(shè)備及示意圖Fig. 1 PL-D3-1812 membrane system and its schematic diagram

1.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.3.1 膜的篩選影響膜分離性能的主要參數(shù)有料液狀況（溶質(zhì)濃度、pH 值、離子強(qiáng)度）、操作條件（跨膜壓差、溫度、循環(huán)流速）和膜結(jié)構(gòu)及其表面特性等。 這些參數(shù)的選擇和優(yōu)化對(duì)實(shí)際膜分離過(guò)程十分重要[14]。膜選型一般是將備選膜用于待分離體系，在不同操作條件下進(jìn)行透過(guò)通量和溶質(zhì)收率測(cè)試，選擇較高透過(guò)通量和滿意收率的膜用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

為了模擬真實(shí)物料，配置體積為10 L，ε-PL 和NaCl 質(zhì)量濃度分別為10 g/L 和5 g/L 的溶液作為料液模擬液。 在恒定的進(jìn)口壓力下（1.0 MPa），對(duì)三種納濾膜在pH 5.0、7.0、9.0 和11.0 條件下采用間歇變?nèi)轁B濾方式進(jìn)行脫鹽， 具體過(guò)程見(jiàn)圖2。 先將V0=10 L 模擬料液濃縮至6 L（Vr，6 L 為設(shè)備的運(yùn)行死體積，低于6 L 無(wú)法保持穩(wěn)定的壓力），隨后加去離子水至料液初始體積V0，如此重復(fù)5 次。 收集透過(guò)液，測(cè)定ε-PL 質(zhì)量濃度和Cl-質(zhì)量濃度，計(jì)算ε-PL 損失率和脫鹽率。

圖2 間歇變?nèi)轁B濾操作流程示意圖Fig. 2 Process of desalination experiments at batch constant volume diafiltration condition

1.3.2 操作模式的優(yōu)化一般情況下，納濾脫鹽的操作模式包括兩個(gè)步驟：濃縮、滲濾[15-17]。 在濃縮階段，隨著產(chǎn)物質(zhì)量濃度增加和溶液粘度上升，納濾膜的濃差極化和膜污染會(huì)變得越來(lái)越嚴(yán)重，通量也會(huì)隨之不斷下降。 因此，濃縮階段將目標(biāo)產(chǎn)品濃縮到何種質(zhì)量濃度將影響到納濾后續(xù)操作。 以往納濾脫鹽研究，一般是通過(guò)考察不同濃縮倍數(shù)對(duì)脫鹽效果的影響[18]。然而，由于工業(yè)生產(chǎn)中每批料液性質(zhì)均會(huì)存在波動(dòng)（如產(chǎn)物質(zhì)量濃度和鹽質(zhì)量濃度），因此以固定產(chǎn)品質(zhì)量濃度代替濃縮倍數(shù)來(lái)考察脫鹽效果將更具有現(xiàn)實(shí)意義。 作者通過(guò)將100 L 的ε-PL模擬料液（ε-PL 和NaCl 質(zhì)量濃度分別為10 g/L 和5 g/L）分別濃縮到不同質(zhì)量濃度（60、80、100 g/L），以考察不同ε-PL 質(zhì)量濃度對(duì)脫鹽的影響。 滲濾階段是整個(gè)過(guò)程中脫鹽最多的階段，而此階段需要加入大量透析水使得鹽分隨著透過(guò)液不斷透過(guò)。 為了減少滲濾時(shí)的耗水量，作者比較了間歇變?nèi)轁B濾和連續(xù)恒容滲濾以及一次性添加三種不同的加水方式對(duì)脫鹽效率的影響， 具體操作過(guò)程見(jiàn)圖3。 圖3（a）為間歇變?nèi)轁B濾，即當(dāng)料液濃縮至10 L 時(shí)，一次性加5 L 去離子水進(jìn)行脫鹽， 當(dāng)透過(guò)液體積為5 L時(shí)再加5 L 去離子水，如此反復(fù)直至脫鹽結(jié)束；圖3（b）為連續(xù)恒容滲濾，即當(dāng)料液濃縮至10 L 時(shí)，用連續(xù)流加去離子水，使去離子水的加入流量和透過(guò)液的流量保持一致，使儲(chǔ)罐料液體積始終保持在10 L左右，直至脫鹽結(jié)束；圖3（c）為一次性添加，當(dāng)體積濃縮至10 L 時(shí)，直接一次性加入90 L 去離子水，待濃縮至10 L 體積時(shí)脫鹽結(jié)束。

圖3 三種操作模式下脫鹽過(guò)程示意圖Fig. 3 Diagram of three diafiltration methods

1.3.3 離交洗脫液納濾脫鹽由于之前所用料液均為ε-PL 模擬料液， 為了考察真實(shí)料液的脫鹽情況， 將1 000 L 離子交換洗脫液 （ε-PL：9.09 g/L、NaCl：4.45 g/L） 進(jìn) 行 納 濾 脫 鹽 實(shí) 驗(yàn)。 納 濾 膜 為SP800， 膜面積為26.5 m2， 進(jìn)口壓力保持為1.0 MPa，脫鹽模式為先濃縮后滲濾，由于每次離子交換后料液質(zhì)量濃度不一，將料液濃縮至所需的質(zhì)量濃度， 隨后根據(jù)優(yōu)化出來(lái)的最優(yōu)滲濾方法進(jìn)行脫鹽，直至透過(guò)液電導(dǎo)率低于300 μS/cm 為止。 收集透過(guò)液，截留液分析數(shù)據(jù)。

1.4 分析方法

ε-PL 質(zhì)量濃度的測(cè)定： 采用甲基橙法測(cè)定[20]；灰分：根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5009.4-2010 測(cè)定[21]；Cl-濃度：通過(guò)硝酸銀滴定方法測(cè)得[22]。

1.5 計(jì)算公式

膜通量J的計(jì)算方程為：

式中， 膜通量J的單位為L(zhǎng)/（m2·h）；Vp代表透過(guò)體積（L）；A代表膜面積（m2）；t代表時(shí)間（h）。

ε-PL 收率的計(jì)算公式為：

式中，cp、cf分別為透過(guò)液和儲(chǔ)料罐中的ε-PL 質(zhì)量濃度（g/L），Vp、Vf分別為透過(guò)液體積和儲(chǔ)料罐中料液的體積（L）。

NaCl 的去除率的計(jì)算公式為：

式中，cp、cf分別為透過(guò)液和儲(chǔ)料罐中的Cl-的質(zhì)量濃度（g/L）；Vp、Vf分別為透過(guò)液體積和儲(chǔ)料罐中料液的體積（L）。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同操作壓力下納濾膜的純水通量

圖4 顯示的是，納濾膜SP800、M8-29 和GE1K在不同操作壓力下的純水通量。 由圖4 可知，隨著操作壓力的增加，三種納濾膜的純水透過(guò)通量均呈線性增加。 在0.1~1.0 MPa 范圍內(nèi)，納濾膜純水通量大小排序?yàn)椋篠P800＞M8-29＞GE1K。 其中，GE1K 純水通量是同等壓力下其他兩種納濾膜的10%左右。一般而言，膜的純水透過(guò)通量越大，相同壓力下單位膜面積的生產(chǎn)效率就越高，也就越適用于實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程。 由此可見(jiàn)，GE1K 不適用于ε-PL 的脫鹽。

圖4 不同壓力下納濾膜的純水通量Fig. 4 Flux of membranes under different pressures

2.2 pH 值對(duì)ε-PL 收率和NaCl 去除率的影響

由于聚酰胺材質(zhì)的納濾膜一般荷負(fù)電荷，而ε-PL 則依據(jù)溶液pH 值不同可以表現(xiàn)出帶正電荷（pH＜9.0）、 負(fù)電荷（pH＞9.0） 和凈電荷為零（pH=9.0）。 因此，有必要考察ε-PL 在不同荷電情況下納濾膜SP800 和M8-29 的脫鹽狀況，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5（a）可知，在pH 5.0~11.0 范圍內(nèi)，兩種納濾膜對(duì)ε-PL 均保持了較高的收率， 達(dá)到91%~95%。 由于ε-PL 相對(duì)分子質(zhì)量存在一定的分布范圍（3 200~4 500），且納濾膜有效截留相對(duì)分子質(zhì)量為其自身截留相對(duì)分子質(zhì)量的5~8 倍，這就造成了ε-PL 收率達(dá)不到100%。 然而，兩種納濾膜的最大ε-PL 收率所對(duì)應(yīng)的pH 值卻不一致。 納濾膜SP800在pH 9.0 時(shí)達(dá)到最大ε-PL 收率（94.4%），納濾膜M8-29 在pH 7.0 時(shí)達(dá)到最大ε-PL 收率 （92.9%）。造成這種差異的原因可能和不同廠家生產(chǎn)制造納濾膜的工藝不同有關(guān)。在NaCl 去除方面（圖5（b）），SP800 和M8-29 保持了較高的一致性，均在pH 9.0時(shí)實(shí)現(xiàn)了最大的NaCl 去除率， 分別達(dá)到88.6%和82.3%。 由于ε-PL 等電點(diǎn)是9.0，此時(shí)ε-PL 結(jié)合鈉離子和氯離子的能力最弱，這可能是造成pH 9.0 是最適脫鹽pH 的根本原因。 宋奇等[23]在研究乳清蛋白的納濾脫鹽過(guò)程中， 也發(fā)現(xiàn)了當(dāng)pH 為乳清蛋白的等電點(diǎn)時(shí)脫鹽效果最好。 圖5（c）顯示，SP800 和M8-29 在pH 5.0~11.0 范圍內(nèi)的膜通量分別穩(wěn)定在50、45 L/（m2·h），表明pH 值對(duì)兩種納濾膜的膜通量影響不明顯。 綜上所述， 納濾膜SP800 在ε-PL 收率、NaCl 去除率和膜通量上均優(yōu)于M8-29。 在pH 9.0 時(shí)，SP800 納濾膜能夠?qū)崿F(xiàn)ε-PL 收率94.4%，NaCl 去除率92.84%和膜通量50 L/（m2·h）。因此，確定SP800 納濾膜用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 不同pH 值對(duì)納濾膜ε-PL 收率、NaCl 去除率和透過(guò)通量的影響Fig. 5 Effect of pH on nanofiltration membrane’s ε-PL rejection ratio，NaCl removal ratio and permeate flux

2.3 ε-PL 質(zhì)量濃度對(duì)納濾膜SP800 滲濾脫鹽過(guò)程的影響

納濾操作一般包括濃縮和滲濾脫鹽兩個(gè)過(guò)程。在濃縮階段，具體將產(chǎn)品濃縮到多少質(zhì)量濃度比較合適，將影響到滲濾脫鹽階段的透析水用量和脫鹽效率。 因此，有必要考察不同質(zhì)量濃度ε-PL 在相同操作條件下的脫鹽效果。如表2 所示，將含有10 g/L ε-PL 和5 g/L NaCl 模擬料液分別濃縮至ε-PL 質(zhì)量濃度為60、80、100 g/L（對(duì)應(yīng)的濃縮倍數(shù)分別為6倍、8 倍和10 倍），考察其納濾過(guò)程的用水量、用時(shí)、脫鹽率和ε-PL 回收率。 由表2 可知，隨著濃縮倍數(shù)的升高，獲得相同的脫鹽效果所消耗的透析水量和用時(shí)均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。 當(dāng)濃縮倍數(shù)達(dá)到10 倍（即ε-PL 質(zhì)量濃度達(dá)到100 g/L）時(shí)，透析水用量只有濃縮6 倍時(shí)的61.5%，用時(shí)也只有58.0%。 由此可見(jiàn)，濃縮倍數(shù)越高，脫鹽效率就越高。 圖6 顯示的是，不同濃縮倍數(shù)條件下，恒容滲濾脫鹽過(guò)程的滲透速率變化趨勢(shì)。 可以看出，濃縮倍數(shù)越低，滲透速率越高。 當(dāng)濃縮倍數(shù)達(dá)到10 倍時(shí)，滲透速率最低，平均通量?jī)H為24 L/（m2·h）。 值得注意的是，當(dāng)濃縮倍數(shù)達(dá)到10 倍時(shí)， 膜通量衰減速率變慢且中后期基本趨于穩(wěn)定。 這是因?yàn)榱弦簼饪s時(shí)，膜表面被截留的溶質(zhì)質(zhì)量濃度不斷增加， 濃差極化不斷加強(qiáng)，特別是當(dāng)料液質(zhì)量濃度為100 g/L 時(shí)， 濃差極化比其他兩個(gè)質(zhì)量濃度更為明顯，表現(xiàn)在滲濾時(shí)膜通量衰減更顯著，但是隨著滲濾的進(jìn)行，濃差極化趨于穩(wěn)定，從而使得膜通量維持在較低的水平。 因此，在納濾濃縮階段，ε-PL 最高濃縮質(zhì)量濃度為100 g/L左右。

表2 不同ε-PL 質(zhì)量濃度下連續(xù)恒容滲濾脫鹽參數(shù)Table 2 Desalination parameters of continuous constant volume diafiltration at different concentrations of ε-PL

圖6 不同ε-PL 質(zhì)量濃度下連續(xù)恒容滲濾膜通量的變化Fig. 6 Changes of permeate flux in continuous constant volume diafiltrationat at different concentrations of ε-PL

2.4 透析水添加方式對(duì)納濾膜SP800 滲濾脫鹽過(guò)程的影響

為了降低濃差極化現(xiàn)象和提高滲透速率，在納濾的脫鹽過(guò)程中向濃縮液中添加去離子水是一種十分有效的方法[24]。 表3 列出了三種透析水添加方式（間歇添加、連續(xù)流加和一次性添加）對(duì)脫鹽效率的影響。 可以看出，在基本相同的脫鹽效果下，連續(xù)恒容滲濾所消耗的去離子水量最少，操作時(shí)間最短且ε-PL 回收率要好于其他操作。 因此，連續(xù)恒容滲濾被確定為納濾脫鹽階段去離子的最佳添加方式。

表3 ε-PL 質(zhì)量濃度為100 g/L 時(shí)不同操作模式脫鹽的比較Table 3 Comparison of desalination parameters at different operation methods under the ε-PL concentration of 100 g/L

2.5 納濾膜SP800 在ε-PL 分離提取工藝中的應(yīng)用

表4 離交洗脫液納濾脫鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of desalination experiment with the ε-PL eluent of from ion exchange step

為了評(píng)價(jià)納濾膜SP800 和脫鹽方式對(duì)真實(shí)物料的脫鹽效果， 我們將納濾膜面積放大到26.5 m2，并用于處理1 000 L 離子交換洗脫液， 結(jié)果見(jiàn)表4和圖7。 由圖7 可知，在納濾濃縮階段，隨著料液的濃縮倍數(shù)增大，透過(guò)液電導(dǎo)率逐漸增加，由起始6 mS/cm 上升到12 mS/cm； 但滲透速率卻迅速下降，由35 L/（m2·h）下降到18 L/（m2·h）。 在納濾脫鹽階段， 透過(guò)液電導(dǎo)率由最高值12 mS/cm 迅速下降至1 mS/cm，隨后緩慢下降；滲透通量由18 L/（m2·h）快速下降并穩(wěn)定在12 L/（m2·h）左右。 由表4 可知，納濾脫鹽過(guò)程中ε-PL 損失率僅為0.77%， 脫鹽率達(dá)到96.43%。 脫鹽后的樣品ε-PL 純度達(dá)到質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.21%， 較脫鹽前提升了31.3%； 干燥樣品灰分為1.02%，低于國(guó)標(biāo)GB2760-2014 灰分≤2.0%的要求。

圖7 納濾脫鹽過(guò)程中電導(dǎo)率和透過(guò)通量變化Fig. 7 Changes of conductivity and flux of permeate in the process of nanofiltration

3 結(jié) 語(yǔ)

作者建立了利用納濾膜對(duì)ε-PL 分離提取過(guò)程中離子交換洗脫液進(jìn)行脫鹽的工藝。 通過(guò)考察純水透過(guò)通量、ε-PL 收率和脫鹽率， 確定了納濾膜SP800 用于ε-PL 脫鹽研究；基于單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，以模擬料液為研究對(duì)象，確定了納濾膜SP800 脫鹽條件為：料液pH 值為9.0，最大濃縮倍數(shù)對(duì)應(yīng)ε-PL濃度為100 g/L 左右， 再加入去離子水以恒容滲濾方式脫鹽， 直到透過(guò)液電導(dǎo)率低于300 μS/cm 為止。 最后，將該脫鹽工藝應(yīng)用到1 000 L 真實(shí)物料，實(shí)現(xiàn)脫鹽率達(dá)到96.43%，ε-PL 損失率0.77%；冷凍干燥后的ε-PL 樣品純度達(dá)到98.21%， 灰分為1.02%，完全滿足國(guó)標(biāo)GB2760-2014 對(duì)樣品中ε-PL純度和灰分的要求。