姚志鴻，熊風，李觀貴，孫青，萬才云，陳培林，鐘惠嫻，曾勇

（深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045）

體外受精／卵胞漿內(nèi)單精子注射－胚胎移植（IVF／ICSI－ET）是治療不孕不育癥的有效手段，胚胎培養(yǎng)是IVF／ICSI－ET中最主要的環(huán)節(jié)，提高胚胎體外發(fā)育潛能和質(zhì)量至關(guān)重要。胚胎是一種具有分泌活性的生物體，研究表明，種植前的胚胎能夠分泌產(chǎn)生各種不同的配體分子，包括生長因子、細胞因子、激素類分子等［1］，并且這些分子可能影響相鄰胚胎的生長發(fā)育，因此，基礎(chǔ)研究理論認為胚胎集合培養(yǎng)可能優(yōu)于單胚胎培養(yǎng)［2］。然而，目前相關(guān)的臨床研究報道較少，結(jié)論也未達成一致［3］?？紤]到優(yōu)質(zhì)胚胎是目前認為分泌“功能分子”促進胚胎共同發(fā)育的關(guān)鍵［4］，因此，本研究選取IVF／ICSI治療的患者優(yōu)質(zhì)胚胎為研究對象，分析不同培養(yǎng)方法對其囊胚培養(yǎng)結(jié)局及移植后臨床結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對象

本研究選取2018年3～10月在本中心接受IVF／ICSI治療的患者作為研究對象。納入標準：女方年齡＜38歲；常規(guī)促排卵方案；第1個IVF或ICSI周期；第3天（Day 3）優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)≥4枚；第5天（Day 5）新鮮單囊胚移植。排除因OHSS風險、子宮內(nèi)膜因素、孕酮高水平等因素取消新鮮周期移植的患者。根據(jù)上述標準，入選206位患者（206個周期），共計優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎1 281枚。

二、研究方法

1．分組：因工作流程變化，2018年7月1日起，本中心對卵裂期胚胎的囊胚培養(yǎng)方式由集合培養(yǎng)改變?yōu)閱闻咛ヅ囵B(yǎng)，以此為時間節(jié)點，將入選人群分為A、B兩組：A組采用單胚胎培養(yǎng)法（后4個月，n＝118），即1個微滴培養(yǎng)1枚胚胎；B組采用集合培養(yǎng)法（前4個月，n＝88），即1個微滴培養(yǎng)2～3枚胚胎。

2．促排卵和受精：根據(jù)患者情況和本中心的標準采用常規(guī)方案促排卵，當18mm以上卵泡≥2個時，肌肉注射HCG（珠海麗珠制藥），34～36h后經(jīng)陰道B超穿刺取卵。男方精液采用不連續(xù)密度梯度離心法處理，取卵后4～6h進行IVF或ICSI受精。

3．卵裂期胚胎培養(yǎng)與質(zhì)量評估：卵裂期胚胎培養(yǎng)兩組均采用單胚胎培養(yǎng)法，培養(yǎng)液為Quinn’s 1026培養(yǎng)液（SAGE，美國），培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、5%O2。受精后第3天采用形態(tài)學評分標準對胚胎進行質(zhì)量評估［5］：1級：卵裂球數(shù)目≥7個，碎片數(shù)量≤10%；2級：卵裂球數(shù)目≥7個，10%＜碎片數(shù)量≤20%；3級：卵裂球數(shù)目≥7個，碎片數(shù)量＞20%或5個≤卵裂球數(shù)目＜7個，碎片數(shù)量≤10%；4級：5個≤卵裂球數(shù)目＜7個，碎片數(shù)量＞10%或卵裂球數(shù)目＜5個。正常受精且Day 3為1級或2級的胚胎定義為優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。

4．囊胚培養(yǎng)與質(zhì)量評估：囊胚培養(yǎng)采用Quinn’s 1029培養(yǎng)液（SAGE，美國），培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、5%O2，培養(yǎng)方式為微滴培養(yǎng)，微滴體積為25～30μl。其中，A組患者每個微滴培養(yǎng)1枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎；B組患者每個微滴培養(yǎng)3枚或2枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。胚胎培養(yǎng)第5天和第6天分別觀察囊胚形成情況并采用Gardner評分標準［6］對囊胚質(zhì)量進行評估。根據(jù)標準，將3期及3期以上擴張程度，內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層評分均達到C級以上定義為優(yōu)質(zhì)囊胚；將3期及3期以上擴張程度，內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層評分至少一個達到C級以上定義為可利用囊胚，即可用于移植及冷凍。

5．新鮮囊胚移植與黃體支持：胚胎培養(yǎng)第5天在B超介導下行新鮮單囊胚移植。黃體支持采用黃體酮凝膠（默克雪蘭諾，瑞士），陰道給藥90mg／d。直至移植后11d抽血檢測HCG。

6．妊娠診斷：囊胚移植后第11天檢測血HCG，HCG≥5U／L定義為HCG陽性。移植后30d經(jīng)B超檢查見宮腔內(nèi)有妊娠囊及胎心搏動判斷為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18．0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，率的差異性分析采用χ2檢驗；P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、兩組患者的基本資料

A、B兩組間女方年齡、體重指數(shù)（BMI）、獲卵數(shù)以及受精率、和優(yōu)質(zhì)胚胎率均無顯著性差異（P＞0．05）（表1）。

二、兩組患者的囊胚培養(yǎng)結(jié)局

A組患者培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎696枚，B組患者培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎585枚。兩組患者囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、可利用囊胚形成率、Day5囊胚形成率和Day6囊胚形成率均無顯著性差異（P＞0．05）（表2）。

三、兩組患者移植后臨床結(jié)局比較

統(tǒng)計分析A、B兩組患者的臨床妊娠情況顯示，兩組的HCG陽性率、臨床妊娠率、繼續(xù)妊娠率和早期流產(chǎn)率均無顯著性差異（P＞0．05）（表3）。

表1 兩組患者基本資料比較［（），%］

表1 兩組患者基本資料比較［（），%］

組 別 周期數(shù) 女方年齡 BMI（kg／m2） 獲卵數(shù) 受精率 優(yōu)質(zhì)胚胎率 移植優(yōu)胚數(shù)A組 118 31．60±3．26 21．65±3．52 14．59±3．40 80．84（1 392／1 722） 67．01（908／1 355）88．14（104／118）B組 88 31．17±3．49 21．68±2．94 14．00±3．22 82．47（1 016／1 232） 67．56（681／1 008）92．05（81／88）

表2 兩組患者的囊胚形成情況比較［n（%）］

表3 兩組患者移植后臨床妊娠情況比較（%）

討 論

改善胚胎培養(yǎng)結(jié)局，提高臨床妊娠率是每個生殖中心研究的方向與重點，建立一套正確的胚胎培養(yǎng)策略對于提高培養(yǎng)效果能起到一個舉足輕重的作用。目前大多數(shù)生殖中心為了方便追蹤胚胎的個體發(fā)育情況，囊胚培養(yǎng)一般采用單胚胎培養(yǎng)的方式［7］，但許多研究表明胚胎在生長發(fā)育過程中可以分泌出許多促進胚胎內(nèi)細胞團發(fā)育，加速囊胚形成的生長因子［8－9］，而 同 時 國 外 許 多 報 道 中 對 小 鼠［10］、綿羊［11］、奶牛［12－14］等動物通過集合培養(yǎng)的方法進行囊胚培養(yǎng)，顯著改善了動物囊胚培養(yǎng)結(jié)局，提示集合培養(yǎng)或許可以成為改善胚胎培養(yǎng)結(jié)局的方法之一。

近年，國外學者 Ebner等［15］和 Bo等［16］均以集合培養(yǎng)和單胚胎培養(yǎng)的方式培養(yǎng)胚胎，以30μl的培養(yǎng)液體積培養(yǎng)于培養(yǎng)液微滴中，集合培養(yǎng)組的培養(yǎng)密度為3～5個胚胎／ml和1～4個胚胎／30μl，發(fā)現(xiàn)集合培養(yǎng)相較單胚胎培養(yǎng)的確可獲得較高囊胚形成率。究其原因很可能是由于胚胎之間通過自分泌或旁分泌的形式促進相鄰胚胎的生長發(fā)育，而集合培養(yǎng)的胚胎相較于單胚胎培養(yǎng)不僅可以加強胚胎之間的交流作用，而且由于培養(yǎng)密度的增大可以提高胚胎分泌于培養(yǎng)液中的生長因子的濃度，從而改善胚胎的囊胚培養(yǎng)結(jié)局。而Tao等［17］將Day 3卵裂期胚胎以2～5個胚胎／50μl的胚胎密度分為A、B組進行集合培養(yǎng)，A組為隨機分配胚胎集合培養(yǎng)，B組為Day 3優(yōu)質(zhì)胚胎集合培養(yǎng)和Day 3非優(yōu)質(zhì)胚胎分別集合培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)集合培養(yǎng)的胚胎中，B組較A組的囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率有顯著性的提高，這提示優(yōu)質(zhì)胚胎可以更有效分泌有益因子或降低不良因子對鄰近胚胎的影響，從而提高了整體囊胚形成水平。

本次研究的206例案例中，主要研究對象為Day3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎，按1～3個胚胎／25μl的培養(yǎng)密度分組培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)集合培養(yǎng)組相較于單胚胎培養(yǎng)組的囊胚形成率、可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率均無顯著性差異（P＞0．05），表明集合培養(yǎng)并不能有效地改善優(yōu)質(zhì)胚胎的囊胚培養(yǎng)結(jié)局。這與上述報道中提到的關(guān)于集合培養(yǎng)改善胚胎培養(yǎng)結(jié)局的結(jié)論不一致，經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)各研究中均采用不同的胚胎培養(yǎng)密度，而 Minasi等［18］和 Munck等［19］則在研究中提到過胚胎培養(yǎng)密度的改變可能會影響囊胚形成率，這可能是導致上述研究結(jié)果不一致的原因之一。

至于兩組間的新鮮單囊胚移植后的臨床結(jié)局，我們通過對比后發(fā)現(xiàn)集合培養(yǎng)組相較單胚胎培養(yǎng)組的HCG陽性率、臨床妊娠率和繼續(xù)妊娠率均有所提高，但均無顯著性差異（P＞0．05）。這與過去報道基本一致［20－21］，即與單胚胎培養(yǎng)法相比，集合培養(yǎng)法無法有效地改善胚胎臨床結(jié)局?；蛟S集合培養(yǎng)存在兩面性：胚胎雖然通過旁分泌的方式產(chǎn)生生長因子促進鄰近胚胎的生長發(fā)育［22］，但同時集合培養(yǎng)可能會導致胚胎發(fā)育過程中分泌的胚胎廢棄物如氨基酸、銨、活性氧等有毒物質(zhì)大量聚集［23－26］，從而影響胚胎發(fā)育潛能，無法改善胚胎的臨床結(jié)局。

綜上所述，雖然實驗設計過程中采用先后時間段不同進行分組而未進行隨機分組，但實驗中使用的培養(yǎng)液質(zhì)控正常，并且培養(yǎng)胚胎的天數(shù)和相關(guān)實驗人員等實驗條件并未改變，所以本實驗誤差對于實驗結(jié)果而言影響相對較小。最終結(jié)果表明對于Day 3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎，集合培養(yǎng)無法有效地改善胚胎囊胚發(fā)育潛能及臨床結(jié)局，相較于單胚胎培養(yǎng)意義不大。采用單胚胎培養(yǎng)法培養(yǎng)胚胎時，不僅可以更好地追蹤胚胎個體的發(fā)育，提高移植胚胎的準確性，同時可以觀察到發(fā)育異常的胚胎從而篩選出發(fā)育良好的胚胎。所以培養(yǎng)Day 3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎時，單胚胎培養(yǎng)法會是一個更好的選擇。而對于非優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎，由于本研究只開展了Day3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎，未對非優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎進行相關(guān)的實驗驗證，所以尚需更多的實驗驗證對于非優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎是否存在著同等效應。