劉衛(wèi)衛(wèi)，韓偉，高洋，郝向偉，黃國(guó)寧

（重慶市婦幼保健院遺傳與生殖研究所，重慶 400013）

在輔助生殖領(lǐng)域，反復(fù)種植失?。≧ecurrent implantation failure，RIF）有多種定義，但通常指實(shí)施移植3次或3次以上形態(tài)學(xué)評(píng)分較高的胚胎而未獲得臨床妊娠［1－4］。RIF的主要原因包括母體因素和胚胎因素［5］。母體因素主要包括子宮異常和母體的異常血栓狀態(tài)或免疫反應(yīng)狀態(tài)等［6－8］；胚胎因素可能是起源于配子或合子發(fā)育異常而導(dǎo)致的胚胎染色體異常［9］。

目前，為了改善RIF的胚胎因素，胚胎學(xué)家試圖通過時(shí)差監(jiān)測(cè)培養(yǎng)系統(tǒng)（Time－lapse Monitoring，TLM）、胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（Preimplantation Genetics Screening，PGS）或囊胚培養(yǎng)來(lái)進(jìn)一步優(yōu)選胚胎。但TLM系統(tǒng)價(jià)格昂貴，并未在國(guó)內(nèi)IVF實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模的推廣和使用。盡管RIF是實(shí)施PGS的指征，考慮到PGS的性價(jià)比和患者的接受度，也并未被廣泛應(yīng)用。囊胚培養(yǎng)，通過延長(zhǎng)胚胎體外培養(yǎng)時(shí)間，進(jìn)一步優(yōu)選胚胎，是目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)IVF實(shí)驗(yàn)室可以實(shí)施且多數(shù)RIF患者可以接受的措施。有多個(gè)研究報(bào)道，在移植胚胎數(shù)目相同的情況下，囊胚移植與卵裂期胚胎移植相比，能夠顯著提高助孕患者的臨床妊娠率和種植率，且不增加圍生期母體和圍生兒的不良結(jié)局［10－12］。但對(duì)RIF患者的囊胚期移植與卵裂期胚胎移植比較的研究相對(duì)較少，尤其是解凍周期中單囊胚移植與卵裂期雙胚胎移植的研究鮮有報(bào)道。

本研究從IVF實(shí)驗(yàn)室角度，回顧性分析我中心2016年1月至2017年12月原因不明RIF且剩余有冷凍的囊胚期或卵裂期胚胎的患者資料，比較其解凍周期實(shí)施單囊胚期移植（Single blastocyst transfer，SBT）和卵 裂 期雙 胚 胎移 植（Double cleavage－stage embryo transfer，DET）患者的臨床條件及助孕結(jié)局，探討解凍周期SBT是否能夠提高該部分RIF患者的助孕結(jié)局。

資料和方法

一、研究對(duì)象

收集我中心2016年1月至2017年12月原因不明RIF且剩余有凍存囊胚期或卵裂期胚胎的患者資料，去除解凍周期雙囊胚移植和卵裂期單胚胎及三胚胎移植周期后，本研究包括109例解凍周期SBT患者（SBT組）和336例解凍周期DET患者（DET組），排除1例SBT未復(fù)蘇周期和3例DET未完全復(fù)蘇周期。另外，本研究排除≥40歲的高齡患者、卵母細(xì)胞凍融周期和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷或篩查周期。

二、研究方法

1．胚胎培養(yǎng)和胚胎評(píng)估：采用我中心個(gè)體化降調(diào)節(jié)和促排卵方案，HCG注射后36～38h行采卵術(shù)（OPU），所獲卵子按常規(guī)進(jìn)行IVF／ICSI授精。授精后16～18h觀察受精情況，并置于卵裂期胚胎培養(yǎng)基（G1＋5%HSA）（Vitrolife，瑞典）中繼續(xù)培養(yǎng)48h后，根據(jù)患者臨床條決定D3新鮮移植、卵裂期胚胎冷凍或囊胚培養(yǎng)后冷凍。實(shí)施囊胚培養(yǎng)的前提條件是D3冷凍卵裂期胚胎不少于4枚，剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，培養(yǎng)至D5／D6形成可用囊胚時(shí)冷凍保存。卵裂期胚胎評(píng)估依據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評(píng)分，包括卵裂速度、碎片程度、卵裂球均一度以及卵裂球出現(xiàn)單核或多核等。D3可用胚胎定義為卵裂球數(shù)目不少于6個(gè)，碎片少于30%且無(wú)明顯形態(tài)學(xué)異常的胚胎。囊胚評(píng)估依據(jù)囊胚擴(kuò)張度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的傳統(tǒng)評(píng)分。D5／D6可用囊胚定義為擴(kuò)張度≥3期且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞至少一項(xiàng)優(yōu)于C級(jí)的囊胚。

2．卵裂期胚胎和囊胚的冷凍和解凍：按照Kuwayama［13］報(bào)道的Crytop方法步驟及商品化試劑盒（Kitazato，日本）進(jìn)行玻璃化冷凍和解凍。

3．胚胎移植和黃體支持：凍融周期采用人工替代周期。當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥7mm，且無(wú)明顯黃體過程時(shí)，給予孕酮黃體支持3d后實(shí)施胚胎解凍復(fù)蘇。其黃體支持包括雌激素和孕激素的補(bǔ)充。對(duì)于解凍周期SBT，解凍1枚胚胎置于囊胚培養(yǎng)基（G2＋6%HSA）（Vitrolife，瑞典）中培養(yǎng)2～4h后移植；對(duì)于解凍周期DET，解凍2枚胚胎置于其上囊胚培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后移植。若妊娠確定，黃體支持應(yīng)持續(xù)至妊娠10周左右。

4．比較指標(biāo)：兩組的比較指標(biāo)主要包括臨床妊娠率、種植率、多胎率和流產(chǎn)率。臨床妊娠和種植是以胚胎移植后5周超聲檢查探及孕囊為標(biāo)準(zhǔn)。多胎是指胚胎移植后5周超聲檢查探及2個(gè)或2個(gè)以上的孕囊。流產(chǎn)是指臨床妊娠28周之前的妊娠丟失。本研究中的率，根據(jù)情況，分別以移植周期數(shù)和妊娠例數(shù)為分母計(jì)算。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用Stata 12．0軟件。計(jì)量資料采用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)描述。連續(xù)變量采用t檢驗(yàn)，分類變量采用卡方檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般臨床資料比較

兩組患者的新鮮周期冷凍胚胎時(shí)年齡（新鮮周期卵齡）、不孕年限、體重指數(shù)（BMI）及解凍周期時(shí)子宮內(nèi)膜厚度、既往ET周期次數(shù)、原發(fā)不孕比例和IVF授精比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）（表1）。

二、助孕結(jié)局比較

SBT組與DET組的臨床妊娠率和種植率分別為（54．1%vs．47．6%）和（56．0%vs．30．1%），差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。SBT組的流產(chǎn)率（2．8%vs．7．1%）低于DET組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），但SBT組的多胎率顯著低于DET組（P＜0．05）（表2）。

表1 SBT與DET的一般臨床資料比較［（），n（%）］

表1 SBT與DET的一般臨床資料比較［（），n（%）］

組 別 周期數(shù) 新鮮周期卵齡 （歲） 不孕年限 BMI（kg／m2）內(nèi)膜厚度（mm）既往移植周期數(shù) 原發(fā)不孕 IVF授精SBT組 109 33．01±4．58 6．34±3．26 21．93±2．45 9．31±1．52 4．21±1．50 69（63．3） 87（79．8）DET組 336 33．01±4．48 6．27±3．31 22．09±2．61 9．34±1．47 4．42±1．43 227（67．6） 265（78．9）

表2 SBT與DET的助孕結(jié)局比較［n（%）］

討 論

本研究回顧性分析本中心部分不明原因RIF患者解凍周期SBT與DET的臨床資料和助孕結(jié)局。納入患者中RIF均為臨床檢查中未明確特定原因的RIF。對(duì)特定原因的RIF患者，如夫婦一方存在染色體異常、母體存在自身免疫性疾病或子宮異常狀態(tài)等，需要特定胚胎植入前遺傳學(xué)診斷或相應(yīng)的內(nèi)科或外科專業(yè)治療，均不屬于本研究之列。另外，高齡（年齡≥40歲）患者胚胎非整倍體率明顯升高，亦不屬于本研究討論范圍。

本研究從胚胎因素著手，探討對(duì)胚胎進(jìn)一步篩選的囊胚培養(yǎng)能否改善不明原因的RIF患者的助孕結(jié)局。不明原因的RIF，多傾向于形成胚胎的配子（精子和卵母細(xì)胞）因素以及胚胎自身因素。有研究報(bào)道，精子DNA損傷與RIF相關(guān)，嚴(yán)重的精子DNA損傷導(dǎo)致囊胚孵出失?。?4］。卵母細(xì)胞為胚胎提供一半遺傳物質(zhì)和全部能量供應(yīng)，其線粒體數(shù)量和功能及其周圍顆粒細(xì)胞的功能狀態(tài)，與囊胚形成和胚胎發(fā)育密切相關(guān)［15－16］。李博等［17］報(bào)道胚胎因素（包括培養(yǎng)微環(huán)境、培養(yǎng)時(shí)間）在不明原因的RIF中發(fā)揮重要作用。多個(gè)報(bào)道包括系統(tǒng)回顧－Meta分析顯示囊胚移植通過延長(zhǎng)胚胎體外培養(yǎng)，在進(jìn)一步篩選胚胎的同時(shí)，使胚胎發(fā)育階段與子宮內(nèi)膜相對(duì)同步，進(jìn)而可提高胚胎種植率［12］。對(duì)不明原因的RIF患者，考慮其可能是精子、卵子或胚胎因素導(dǎo)致的胚胎自身缺陷，延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間的囊胚培養(yǎng)有利于進(jìn)一步胚胎篩選，從而改善該部分患者的助孕結(jié)局［18］。本研究的結(jié)果證實(shí)這種考慮的可能性，為不明原因RIF患者提供一種新的移植策略。

本研究屬于回顧性研究，存在諸多局限性和缺點(diǎn)。首先，兩組之間的樣本量差別較大，使得統(tǒng)計(jì)的結(jié)果可能存在偏移。其次，實(shí)施囊胚培養(yǎng)的前提條件是D3冷凍卵裂期胚胎不少于4枚，剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，培養(yǎng)至D5／D6形成可用囊胚時(shí)冷凍保存，提示SBT組患者D3形成可用胚胎相對(duì)較多，其胚胎發(fā)育潛能相對(duì)較高，兩組的前提條件可能存在差別，導(dǎo)致結(jié)果可能向SBT組偏移。另外，由于本中心新鮮移植周期實(shí)施卵裂期胚胎移植，極少實(shí)施新鮮囊胚移植，本研究?jī)H涉及解凍移植周期，使得結(jié)果不夠充分。因此，需要新鮮移植周期或解凍移植周期的前瞻性隊(duì)列研究對(duì)本研究的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。