李佳慧 徐文琦 吳飛珍

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細(xì)胞腫瘤，也是第二大最常見的惡性血液腫瘤，發(fā)病率約占所有血液病的13%，占所有腫瘤的1%［1］，每年全世界約有130，000 新增MM 病例［2］。其臨床癥狀表現(xiàn)為漿細(xì)胞定植骨髓微環(huán)境、產(chǎn)生單克隆抗體，引發(fā)貧血、溶骨性骨損傷、腎功能衰竭，以及免疫缺陷等。幾乎所有的MM 患者均會經(jīng)歷一個惡性前階段，即具不明意義的單克隆丙種球蛋白病（monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS）， 隨后發(fā)展為惡性前無癥狀多發(fā)性骨髓瘤（smoldering multiple myeloma，SMM），最后是有癥狀的惡性MM（multiple myeloma，MM）。MM 目前仍是一種高病死率的不可治愈的惡性腫瘤。

大量對臨床患者的遺傳學(xué)研究顯示，MM 具有較高的異質(zhì)性和個體間差異［3-4］，根據(jù)初步的核型分析可以將MM 分為兩類：超二倍體型（hyperdiploid MM）和非超二倍體型（non-hyperdiploid MM），前者是指患者通常含有一至多個奇數(shù)號染色體的三體現(xiàn)象，如3，5，7，9，11，15，19，21 號染色體，所以染色體數(shù)目會在48～75 之間變化，而后者通常是包含涉及免疫球蛋白重鏈基因位點的染色體易位［5］，后者發(fā)病率更高，約占70%，臨床顯示非超二倍體型的MM 預(yù)后更差［6］。t（4；4）型MM 是指在MM 患者中存在4 號染色體p16 區(qū)域與14 號染色體q32 區(qū)域的易位，這是MM中第二大常見的一種染色體易位變異，發(fā)病率約占所有MM 的15%～20%［7］，這種易位會導(dǎo)致兩個基因的過表達(dá)—FGFR3 和NSD2［8］。但臨床數(shù)據(jù)研究顯示只有70%左右的t（4；14）患者會發(fā)生FGFR3 的過表達(dá)，而所有的都會發(fā)生NSD2 的過表達(dá)［9］，說明NSD2在t（4；14）MM 病程中發(fā)揮更重要和更普遍的作用，因此研究清楚NSD2 在其中的作用機(jī)制對于t（4；14）MM 的治療具有重要意義。

1 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶NSD2的結(jié)構(gòu)與功能

Nuclear receptor binding SET domain 2 protein（NSD2），也叫做multiple myeloma SET domain protein（MMSET） 或 者Wolf-Hirschchorn syndrome candidate 1（WHSC1），是一個組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，屬于NSD 家族，該家族成員還包括NSD1 和NSD3［10］。NSD2 基因位于4 號染色體p16.3 區(qū)域，約120kb，包含24 個外顯子，存在兩種可變剪切轉(zhuǎn)錄本和三種蛋白亞型，Ⅰ型轉(zhuǎn)錄本編碼的NSD2 有647 個氨基酸（short-type），Ⅱ型轉(zhuǎn)錄本編碼的NSD2 有1365 個氨基酸（long-type），此外，還存在一個從NSD2 內(nèi)部內(nèi)含子開始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的蛋白亞型response element Ⅱ binding protein（RE-ⅡBP），三種蛋白亞型的結(jié)構(gòu)如圖1 所示，NSD2 是一個多結(jié)構(gòu)域蛋白，Ⅱ型含有1 個SET甲基轉(zhuǎn)移酶活性結(jié)構(gòu)域，2 個PWWP 結(jié)構(gòu)域，一個HMG 結(jié)構(gòu)域和4 個PHD 鋅指結(jié)構(gòu)域，后三種結(jié)構(gòu)域?qū)SD2 與其他蛋白的結(jié)合、組蛋白修飾的識別以及染色質(zhì)定位有重要作用；I 型NSD2 不包含SET 催化結(jié)構(gòu)域，但仍可能通過與其他蛋白的相互作用發(fā)揮染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)功能；RE-Ⅱ BP 與Ⅰ型NSD2 碳端部分重疊，不包含氮端核定位序列，可能主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移酶活性，甲基化非組蛋白底物。

關(guān)于NSD2 的催化底物此前的研究比較混亂，最早的研究報道稱NSD2 是H4K20 甲基轉(zhuǎn)移酶［11］，此后一系列研究又發(fā)現(xiàn)NSD2 還可以催化H3K4me2、H3K9me2、H3K27me3、H3K36me2、H3K36me3 和H4K20me2 等組蛋白修飾［12］，這些不一致的結(jié)果可能主要是由采用的實驗方法和材料差異導(dǎo)致的，比如利用合成的帶某種修飾的肽段或組裝的核小體或體內(nèi)純化的核小體進(jìn)行體外pull-down 實驗時，結(jié)果會有差異，最新的研究確認(rèn)NSD2 主要發(fā)揮K3K36me2 甲基轉(zhuǎn)移酶活性［13］。

NSD2 在個體發(fā)育中有著重要作用，NSD2 單倍體劑量不足會導(dǎo)致Wolf-Hirschchorn 綜合征，臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、智力低下、先天性心臟病以及抗體產(chǎn)生缺陷等［14］。NSD2與癌癥發(fā)生也密切相關(guān)，所有（t4；14）MM 中都存在NSD2 的過表達(dá)，在胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、皮膚癌中也存在過表達(dá)［15］，且其過表達(dá)與膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤的預(yù)后差相關(guān)［16］，此外，有研究發(fā)現(xiàn)在多種兒童急性淋巴白血病細(xì)胞系中存在E1099K 的突變，該突變導(dǎo)致NSD2 增強(qiáng)的甲基轉(zhuǎn)移酶活性［17］。

圖1 不同NSD2蛋白亞型結(jié)構(gòu)

2 NSD2在t（4；14）MM中的致病機(jī)制

NSD2 是一種表觀修飾酶，通過組蛋白甲基化修飾可以直接調(diào)控基因表達(dá)。NSD2 催化產(chǎn)生H3K36me2，H3K36me2 可調(diào)控基因表達(dá)。NSD2 可與其它組蛋白修飾酶、microRNA，以及其他蛋白相互作用。下面從四方面介紹NSD2 在MM 中的致病機(jī)制。

2.1 NSD2 催 化H3K36me2 調(diào) 控 基 因 表 達(dá) t（4；14）MM 中NSD2 的過表達(dá)會引發(fā)全基因組水平的H3K36me2 水平的升高［18］，基因體內(nèi)H3K36me2 是基因轉(zhuǎn)錄激活的一個標(biāo)記，因此許多下游與細(xì)胞周期、EMT、細(xì)胞遷移以及凋亡有關(guān)的原癌基因會被上調(diào)，促進(jìn)MM 的發(fā)生發(fā)展。Jonathan D. Licht 研究組2011年率先在全基因組水平研究了NSD2 過表達(dá)對MM 細(xì)胞系KMS11 基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)H3K36me2 全基因組水平的升高與基因轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，通過比較NSD2過表達(dá)、敲低、敲除以及回補(bǔ)的四種不同細(xì)胞系的基因表達(dá)譜鑒定到一組NSD2 的靶基因，KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要與細(xì)胞死亡、細(xì)胞周期、DNA 修復(fù)以及細(xì)胞粘附有關(guān)［18］。同年Or Gozani 研究組發(fā)表的工作也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，NSD2 通過其組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性引起KMS11 細(xì)胞系全基因組H3K26me2 水平的升高，而基因表達(dá)水平與H3K36me2 水平呈正相關(guān)，定量PCR 驗證了TGFA，PAK1，MET，RRAS2 等基因直接受NSD2 的調(diào)控，H3K36me2 水平的升高導(dǎo)致了原癌基因的上調(diào)［13］，因此，在KMS11 細(xì)胞系中通過shRNA 敲低NSD2 或者通過同源重組的方式敲除易位的NSD2 基因都會抑制MM 的細(xì)胞增殖，促使細(xì)胞凋亡，抑制其腫瘤生成［13，18-19］，而在無t（4；14）的MM 細(xì)胞系中過表達(dá)NSD2 后再進(jìn)行荷瘤實驗可以促進(jìn)其成瘤性［13，18］。此外，在前列腺癌和子宮內(nèi)膜癌中都發(fā)現(xiàn)NSD2 會提高轉(zhuǎn)移相關(guān)基因TWIST1 基因體區(qū)域的H3K36me2 水平，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲［20］，而在t（4；14）的MM 中也存在NSD2 調(diào)控的TWIST1 的表達(dá)上調(diào)。

2.2 NSD2 與其它組蛋白修飾酶的相互作用 研究發(fā)現(xiàn)t（4；14）MM 細(xì)胞系中NSD2 過表達(dá)引起全基因組H3K36me2 水平升高的同時會引起H3K27me3 水平的降低，H3K27me3 是基因沉默的一個標(biāo)記，雖然全基因組H3K27me3 水平的降低導(dǎo)致了多種基因的上調(diào)，但是特定位點的H3K27me3 水平又會升高，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制，因此t（4，14）MM 細(xì)胞系對EZH2 抑制劑的處理敏感，EZH2 抑制劑可使t（4，14）MM 細(xì)胞系生長受到抑制［21-22］。Relja Popovic 研究組2004 年發(fā)表的工作發(fā)現(xiàn)在NSD2 表達(dá)水平低的MM 細(xì)胞系中EZH2結(jié)合水平低以及H3K27me3 比較少的位點，會在NSD2表達(dá)水平高的細(xì)胞系中出現(xiàn)EZH2 結(jié)合水平升高，許多在NSD2 表達(dá)水平高的細(xì)胞系中特有的EZH2 的基因組結(jié)合峰位于CTCF 位點，CTCF 位點是已知的絕緣子，NSD2 上調(diào)會在基因組上建立組蛋白修飾的邊界，導(dǎo)致絕緣子另一側(cè)基因EZH2 結(jié)合水平和H3K27me3水平的升高，表達(dá)受到抑制［22］。NSD2 的表達(dá)同時受到EZH2 的 調(diào) 控，miR-203，miR-26a 和miR-31 都是抑癌性microRNA，可以降低NSD2 的mRNA 的穩(wěn)定性從而下調(diào)原癌基因NSD2 的表達(dá)，但EZH2 介導(dǎo)的H3K27me3 會抑制這類microRNA 的表達(dá)從而上調(diào)NSD2 的表達(dá)水平［23］，這也說明了NSD2 和EZH2 之間的緊密聯(lián)系。此外，NSD2 還可以與KAP1 復(fù)合物以及組蛋白去乙?；附Y(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用［24-25］。

2.3 NSD2 與microRNA 的相互作用 MicroRNA 主要通過調(diào)控mRNA 的穩(wěn)定性、影響靶基因的表達(dá)來發(fā)揮其生物效應(yīng)，而microRNA 本身的表達(dá)又會受到表觀修飾和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。D-J Min 等研究者通過轉(zhuǎn)錄組分析鑒定到miR-126*是NSD2 的一個靶標(biāo)，而miR-126*又可以靶向c-myc mRNA 的3’非翻譯區(qū)抑制其翻譯過程，染色質(zhì)免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)NSD2 會和KAP1 以及HDAC1 共同結(jié)合在miR-126*的宿主基因啟動子區(qū)域，形成H3K9me3 標(biāo)記抑制其表達(dá)，因此，外源過表達(dá)miR-126*可以顯著降低t（4；14）MM 細(xì)胞系的增殖速率［25］。此外，對正常漿細(xì)胞、MGUS 漿細(xì)胞以及MM 漿細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析鑒定到多種在MM 中異常轉(zhuǎn)錄的microRNA，如發(fā)揮抑癌作用的miR-196b、miR-135b、miR-320、miR-20a、miR-19b、miR-19a 和miR-15a 等的下調(diào)，發(fā)揮促癌作用的miR-17-92 簇、miR-221/222 簇等的上調(diào)［26］，但這些micro-RNA 的異常轉(zhuǎn)錄是否受到NSD2 的調(diào)控有待進(jìn)一步驗證。

2.4 NSD2 與其他蛋白的相互作用 組蛋白修飾酶介導(dǎo)組蛋白的各種轉(zhuǎn)錄后修飾，可以影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，但組蛋白修飾酶被靶向至特定基因位點或特定的基因組位置的機(jī)制尚不清楚，NSD2 亦然。因此，研究與NSD2 存在相互作用的蛋白對深入了解其功能和作用機(jī)制具有重要作用。蛋白免疫共沉淀和質(zhì)譜結(jié)果顯示NSD2 與IQGAP1、TIAM1 蛋白存在相互作用［27］，這兩個蛋白可以和β-catenin 相互作用參與到WNT 信號通路，基因表達(dá)譜顯示NSD2 的敲低會顯著下調(diào)CCND1 的表達(dá)，且染色質(zhì)免疫共沉淀顯示NSD2 會結(jié)合到Ccnd1 啟動子區(qū)域［28］，而CCND1又是β-catenin/Tcf4 復(fù)合物的下游靶基因，說明NSD2和β-catenin 之間可能存在相互作用共同調(diào)節(jié)其下游靶基因，而WNT/β-catenin 信號通路又在個體發(fā)育和前列腺癌中發(fā)揮重要作用，這與NSD2 異常會影響個體發(fā)育以及在前列腺癌中存在NSD2 的過表達(dá)相一致，說明了二者之間的聯(lián)系。Yang P 等研究者發(fā)現(xiàn)在對閹割治療有耐受的前列腺癌細(xì)胞中，NSD2 可以和NF-κB 直接相互作用共同激活其下游靶基因的表達(dá)，如IL-6、IL-8、VEGFA、BCL-2、BIRC5、c-MYC 和CCND1 等，染色質(zhì)免疫共沉淀實驗也證明NSD2 和NF-κB 在這些基因位點存在共定位，NSD2 的表達(dá)又會通過NF-κB 受到細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6 的調(diào)控，NSD2 的過表達(dá)又會反過來與NF-κB 共轉(zhuǎn)錄激活其下游靶標(biāo)，因此導(dǎo)致NF-κB 通路的持續(xù)激活［28］，但這一蛋白相互作用以及調(diào)控環(huán)路是否在MM 中也存在有待進(jìn)一步驗證。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)在t（4；14）MM 細(xì)胞系KMS11 中存在NSD2 和PARP1 的相互作用，后者可以催化NSD2 發(fā)生多聚ADP 核糖基化而抑制NSD2 在染色質(zhì)上的結(jié)合［29］。

3 展望

現(xiàn)有研究表明，NSD2 是t（4；14）型MM 發(fā)生發(fā)展的核心調(diào)控因子，研究清楚NSD2 在t（4；14）型MM 中的具體致病機(jī)制將有助于治療MM 的新藥開發(fā)。研究表明在MM 中，存在NSD2 和EZH2 的相互作用，且利用小分子抑制劑對EZH2 進(jìn)行干擾確實能抑制MM 細(xì)胞的增殖，這一作用能否被發(fā)展為臨床治療有待進(jìn)一步研究，一些microRNA 的過表達(dá)也可以達(dá)到抑制MM 細(xì)胞增殖的效果，但microRNA 如何給藥以及如何靶向特定類型細(xì)胞仍是個問題。此外，DNA 甲基化也是一個很重要的表觀調(diào)控機(jī)制，在NSD2 介導(dǎo)的全基因組H3K36me2 的變化以及基因表達(dá)譜的變化中，是否存在和DNA 甲基化的相互作用值得研究，但目前已有研究表明利用5-aza 抑制DNA 的甲基化也能起到抑制MM 細(xì)胞增殖的作用［30］，具體作用機(jī)制有待清楚闡明；最后，針對NSD2 的靶向抑制看似是最為直接的方式，所以需要進(jìn)一步研究清楚NSD2 發(fā)揮其催化功能的具體方式和關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，從而可以針對不同結(jié)構(gòu)域來設(shè)計或篩選小分子抑制劑，近期的幾項研究通過高通量篩選已經(jīng)鑒定到多個靶向NSD2 的小分子抑制劑，能否被應(yīng)用于臨床治療未來還需要進(jìn)一步的研究。