林美璇 周小滿(mǎn) 關(guān)鋒 崔文璟

（1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122；2. 西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710069）

磷脂酶C 是一種可以水解磷脂的酶［1］，近年來(lái)對(duì)磷脂酶C 在油脂的酶法脫膠方面應(yīng)用的研究非常廣泛［2］。磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（Phosphatidylinositol-specific phospholipase C，PIPLC）是眾多磷脂酶C 中的一類(lèi)，可以特異性作用于磷脂酰肌醇（PI，PIP，PIP2）的磷酸二酯鍵，使之分解為結(jié)合在膜上的二酰甘油（Diacylglycerol，DAG）和水溶性磷酸肌醇（InsP，InsP2，InsP3）。PIPLC 普遍存在于原核生物和真核生物體內(nèi)，其中來(lái)源于真核生物的PI-PLC 分子量通常為85-150 kD，在高等生物體內(nèi)PI-PLC 在多種受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中扮演著重要的角色［3］。

大多數(shù)來(lái)源于原核生物體的PI-PLC 分子量為30-35 kD，來(lái)源于原核生物和真核生物體的PI-PLC的催化結(jié)構(gòu)域極為相似，但催化結(jié)構(gòu)域中不同的部分導(dǎo)致二者來(lái)源的PI-PLC對(duì)底物的作用略有不同［4］，其中微生物中的PI-PLC 可以直接專(zhuān)一作用于PI，而真核生物中的PI-PLC 作用時(shí)需要Ca2+等調(diào)節(jié)因子的輔助且還可以作用于底物磷脂酰肌醇4，5-二磷酸酯（PIP2）［5］。PI-PLC 在蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌等微生物中表達(dá)量較高。值得一提的是來(lái)自蠟狀芽孢桿菌的PI-PLC的晶體結(jié)構(gòu)顯示該酶由具有TIM 桶型結(jié)構(gòu)的單個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其與哺乳動(dòng)物PI-PLC 的催化結(jié)構(gòu)域非常相似［6］，與人類(lèi)致病性寄生蟲(chóng)布魯斯錐蟲(chóng)產(chǎn)生的糖基磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（GPI-PLC）有很高的序列相似性，與其它大多數(shù)微生物來(lái)源的PI-PLC 不同的是，來(lái)自致病菌蠟狀芽孢桿菌的PI-PLC 并不作為毒力因子［7］。

糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白（Glycosylphosphatidylinositol-anchored protein，GPI-AP）普遍存在于細(xì)胞表面，蛋白通過(guò)GPI 錨固定在細(xì)胞膜上。GPI 錨主要結(jié)構(gòu)為一分子磷酸乙醇胺、一分子磷脂酰肌醇以及一個(gè)聚糖核心［8］。目前已經(jīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中鑒定出150 多種GPI-APs，這些蛋白在哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，而這些蛋白錯(cuò)誤的翻譯后修飾可能會(huì)引發(fā)多種疾?。?］。由于PI-PLC 可以作用于磷脂酰肌醇，可以將GPI-APs 從細(xì)胞膜上釋放出來(lái)［10-11］，因而PI-PLC 也被應(yīng)用于對(duì)細(xì)胞表面GPI-APs 的研究和鑒定。另外，有證據(jù)表明，寄生蟲(chóng)表面存在大量GPI-APs，其中一些GPI-APs 與寄生蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞這一過(guò)程密切相關(guān)［12］，因此利用PI-PLC 替代抗生素來(lái)抵抗寄生蟲(chóng)具有廣闊的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與細(xì)胞系 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)、大腸桿菌BL21 感受態(tài)購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1 由本實(shí)驗(yàn)室保藏。膀胱癌細(xì)胞KK47 由美國(guó)華盛頓大學(xué)SI Hakomori 院士惠贈(zèng)。

1.1.2 酶及相關(guān)試劑 高保真聚合酶2×Phanta Max Master Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶BamH I、EcoR I 購(gòu)于NEB；DNA marker、solution I 購(gòu)自日本TaKaRa 公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)于Magen（美基）生物；DNA片段純化試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；氨芐青霉素、紅霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Protein marker 購(gòu)于賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）；p-nppc 購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；GST 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購(gòu)于碧云天試劑公司；CD59 抗體購(gòu)于美國(guó)SantaCruz Biotechnology 公司；HRP 標(biāo)記二抗、ECL 發(fā)光試劑購(gòu)自碧云天公司，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 PI-PLC 基因的合成 以NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的來(lái)源于蠟狀芽孢桿菌的PI-PLC 基因（GenBank：M30809.1）為模板，根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化后，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成基因合成。

1.2.2 PI-PLC 基因的克隆 利用Snap Gene 軟件以合成的基因片段為模板設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增引物P1（5′-CGGGATCCATGGCAAGCAGCGTTAA-3′ 下 劃 線處為BamH I 酶切位點(diǎn)）和P2（5′-GGAATTCCTCGA GTTCTTTAATCAGGCTT-3′下劃線處為EcoR I 酶切位點(diǎn)）。引物合成由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

以合成基因?yàn)槟０?，以P1/P2 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系如下：1 μL PI-PLC 合成基因，上游引物和下游引物各5 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL，滅菌的雙蒸水14 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸1 min，29 個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min。利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析，利用DNA片段純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增的PI-PLC 產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.3 重組大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建 提取表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1，利用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I 和EcoR I對(duì)純化后的目的基因和表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1 在37℃條件下進(jìn)行酶切處理，純化回收，利用solution I 于16℃金屬浴中連接3 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，利用含有氨芐抗性的LB 固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，挑取平板上帶有氨芐抗性的單菌落，利用質(zhì)粒pGEX-6P-1 測(cè)序引物進(jìn)行菌落PCR，選取擴(kuò)增出與目的基因大小相同片段的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，將重組子的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pGEX-6P-1-PI-PLC，提取測(cè)序正確的質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化于E.coliBL21（DE3）中，將轉(zhuǎn)化子保存于-80℃甘油管中。

1.2.4 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及SDSPAGE 凝膠電泳檢測(cè) 將重組大腸桿菌pGEX-6P-1-PI-PLC/DE3 及對(duì)照于氨芐抗性LB 培養(yǎng)基37℃、200 r/min 條件下過(guò)夜培養(yǎng)。以5%接種量將重組菌轉(zhuǎn)接至20 mL 氨芐抗性LB 培養(yǎng)基，37℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)至菌液長(zhǎng)至OD600nm為0.6-0.8 時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG 于16℃進(jìn)行誘導(dǎo)（終濃度0.1 mmol/L），12 h 后將收集到的菌液以6000 r/min 離心10 min 收集菌體，用4 mL 濃度為T(mén)ris-HCl（pH7.2）緩沖液重懸菌體，冰浴破碎至菌體澄清，14000 r/min、4℃離心15 min，收集上清液。

根據(jù)GST 純化試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)PI-PLC 進(jìn)行純化，把純化液加入10 kD 離心管，6000 r/min 離心10 min 對(duì)目的蛋白進(jìn)行除鹽、濃縮。取30 μL 純化液，加入5×loading buffer，100℃水浴加熱10 min。用5%濃縮膠、10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，鑒定目的基因是否表達(dá)。

1.2.5 PI-PLC 比酶活的測(cè)定 由于PI-PLC 可以水解甘油磷脂結(jié)構(gòu)類(lèi)似物對(duì)硝基苯酚磷酸膽堿（p-NPPC）產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚（有色基團(tuán)），對(duì)硝基苯酚在410 nm 處有最大吸收峰，可以用p-NPPC 為底物測(cè)量PIPLC 酶的酶活［13］。首先繪制對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線：用濃度為25 mmol/L Tris-HCl（pH7.2）分別配置8 nmol/mL、12 nmol/mL、20 nmol/mL、40 nmol/mL、60 nmol/mL 濃度的對(duì)硝基苯酚，取200 μL 上述溶液并利用酶標(biāo)儀測(cè)量其在410 nm 處的吸光值。

在含有濃度為25 mmol/L 的Tris-HCl（pH7.2）、10 mmol/L 濃度的p-NPPC 的反應(yīng)體系中加入20 μL發(fā)酵酶液，37℃條件下反應(yīng)30 min 后立即用酶標(biāo)儀測(cè)量反應(yīng)液在410 nm 處的吸光度，通過(guò)吸光值計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚進(jìn)而計(jì)算PI-PLC 酶的活性。酶活定義為：在pH7.2、37℃的條件下，每分鐘水解p-NPPC 產(chǎn)生1 nmol 的對(duì)硝基苯酚所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）。

利用BCA 法繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線并測(cè)定純化后酶的蛋白濃度，進(jìn)而計(jì)算出比酶活。

1.2.6 誘導(dǎo)表達(dá)條件的初步優(yōu)化 此實(shí)驗(yàn)在方法1.2.4 的基礎(chǔ)上通過(guò)改變誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑IPTG 濃度、誘導(dǎo)試劑、接種量等單因子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化。根據(jù)方法1.2.5 測(cè)定單位體積發(fā)酵液的酶活，每個(gè)因素做3 個(gè)平行。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 KK47 細(xì)胞在含10%體積分?jǐn)?shù)胎牛血清、1%體積分?jǐn)?shù)青霉素和鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中，37℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度后，用生理鹽水清洗細(xì)胞，加入200 μL PI-PLC 純化液37℃處理1 h，處理后用PBS 緩沖液清洗細(xì)胞表面。

1.2.8 PI-PLC 處理細(xì)胞并用Western blot 技術(shù)進(jìn)行檢測(cè) 用RIPA 緩沖液（1%體積分?jǐn)?shù)NP-40、0.5%體積分?jǐn)?shù)脫氧膽酸鈉、1%體積分?jǐn)?shù)SDS、0.1%體積分?jǐn)?shù)PMSF）裂解細(xì)胞，BCA 法測(cè)定樣品蛋白濃度進(jìn)行定量，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，3%體積分?jǐn)?shù)胎牛血清蛋白封閉，CD59 抗體（用PBS 1 ∶1000稀釋?zhuān)?℃雜交過(guò)夜，PBST 洗膜后加入適量HRP 標(biāo)記的二抗室溫溫育1 h，進(jìn)行ECL 顯色。

1.2.9 流式檢測(cè) 將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組（細(xì)胞用4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)多聚甲醛固定，用二抗孵育）、PI-PLC處理組（細(xì)胞用4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)多聚甲醛固定，用100 μL PI-PLC 純化液于37℃條件下處理30 min，孵育CD59 抗體，孵育二抗）、未用PI-PLC 處理組（細(xì)胞用4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)多聚甲醛固定，孵育CD59 抗體，孵育二抗）流式細(xì)胞術(shù)分析PI-PLC 對(duì)細(xì)胞表面的CD59 的酶切情況。

2 結(jié)果

2.1 目的片段與基因表達(dá)載體的獲得與鑒定

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)源于蠟樣芽孢桿菌的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 基因成熟肽部分為模板，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性對(duì)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并合成優(yōu)化序列。以合成基因?yàn)槟０澹肞CR 對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在1000 bp 處有明顯條帶（圖1-B）。

圖1 基因表達(dá)載體pGEX-6P-1-PI-PLC 的構(gòu)建

2.2 基因表達(dá)載體的構(gòu)建

利用重組質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)BamH I 和EcoR I 來(lái)鑒定目的基因PI-PLC 是否在質(zhì)粒上正確連接。提取質(zhì)粒并酶切處理后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)一條1000 bp 左右目的基因片段和一條5000 bp左右的載體片段，與預(yù)期相符，結(jié)果如圖1-A 所示。載體測(cè)序結(jié)果正確。

2.3 PI-PLC在大腸桿菌中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)表達(dá)菌株BL21（DE3）中，根據(jù)1.2.4 的方法誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)PIPLC。構(gòu)建的重組菌成功表達(dá)出分子量約為61 kD 帶有GST 標(biāo)簽蛋白的重組蛋白（圖2）。

2.4 利用GST標(biāo)簽蛋白純化PI-PLC

使用GST蛋白純化試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，利用SDS-PAGE 對(duì)純化結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要存在于誘導(dǎo)后的重組菌裂解液上清中，純化過(guò)程中目的蛋白損失較少，得到的目的蛋白純度較高（圖2）。

圖2 利用SDS-PAGE 鑒定重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

2.5 誘導(dǎo)表達(dá)條件的初步優(yōu)化及比酶活測(cè)定

誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)、接種量、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)誘導(dǎo)劑濃度的不同對(duì)單位體積發(fā)酵液酶活的影響如圖3 所示。根據(jù)1.2.6 的方法改變不同單一變量并測(cè)定單位體積發(fā)酵液酶活的變化從而確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。不改變其他條件，選取發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)分別為12 h、24 h、36 h、48 h，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為24 h 時(shí)單位體積發(fā)酵液的酶活達(dá)到最高值1039.77 U/mL（圖3-A）；保持其他條件不變，分別選取發(fā)酵液接種體積分?jǐn)?shù)1%、3%、5%、7%、9%，當(dāng)發(fā)酵液接種體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，單位體積發(fā)酵液的酶活最高，可以達(dá)到1807.67 U/mL（圖3-B）；不改變其他條件，菌體在600 nm 下吸光值分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)，當(dāng)菌體在600 nm 下吸光值為0.5，單位體積發(fā)酵液的酶活最高，可以達(dá)到900.67 U/mL（圖3-C）；保持其他條件不變，誘導(dǎo)劑濃度分別選取0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L、0.9 mmol/L，當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度為0.3 mmol/L 時(shí)，單位體積發(fā)酵液的酶活最高，為1353.28 U/mL（圖3-D）。綜合上述結(jié)果，本研究以接種體積分?jǐn)?shù)5%接種，待菌體生長(zhǎng)OD600nm達(dá)到0.5，以0.3 mmol/L 濃度IPTG 誘導(dǎo)24 h為最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。

在最佳條件下發(fā)酵PI-PLC 并純化，純化后酶的質(zhì)量濃度為0.52 mg/mL，20 μL 純化酶液含有酶活為14 U，經(jīng)計(jì)算比酶活為1322.5 U/mg。

圖3 誘導(dǎo)表達(dá)條件的初步優(yōu)化

2.6 用PI-PLC處理膀胱癌細(xì)胞

CD59 是一個(gè)典型的GPI 錨定蛋白，普遍存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面，可以通過(guò)檢測(cè)CD59 的表達(dá)情況衡量PI-PLC 對(duì)GPI 錨定蛋白的酶切效果，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖4-A 所示。將培養(yǎng)過(guò)夜的膀胱癌細(xì)胞KK47經(jīng)PI-PLC 酶液處理后，提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)SDSPAGE 和Western blot 檢測(cè)，結(jié)果（圖4-B）顯示經(jīng)PI-PLC 酶處理后，細(xì)胞樣品中GPI 錨定蛋白CD59的表達(dá)明顯減少。同樣，將酶切處理的細(xì)胞上樣至細(xì)胞流式儀，可以明顯觀察到經(jīng)酶切處理細(xì)胞的GPI 錨定蛋白CD59 的表達(dá)顯著減少（圖4-C）。由此證明本文表達(dá)的PI-PLC 可有效地將GPI 錨定蛋白從細(xì)胞膜上釋放下來(lái)。

3 討論

國(guó)外對(duì)磷脂酶C 的基因序列、結(jié)構(gòu)、功能、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用等相關(guān)研究開(kāi)始較早，對(duì)細(xì)菌來(lái)源的磷脂酶C 在不同體系內(nèi)的克隆表達(dá)和其在工業(yè)和醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用也有報(bào)道［14-15］。相比較而言，國(guó)內(nèi)對(duì)細(xì)菌來(lái)源的磷脂酶C 尤其是磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 的研究較少，主要集中在磷脂酶C 在油脂脫膠、飼料抗蟲(chóng)等方面的應(yīng)用研究。2016 年，湯先澤［16］對(duì)磷脂酰肌醇進(jìn)行了異源表達(dá)，并對(duì)其粗酶液的抗雞球蟲(chóng)效果進(jìn)行了初步分析；2019 年，鄒全等［17］對(duì)磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C 和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并利用其粗酶液對(duì)兩種酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析并應(yīng)用于油脂脫膠，然而，對(duì)磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 的純化及其酶活性研究較少。同時(shí)，GPI 錨定的形式可以使細(xì)胞膜表面結(jié)合更多蛋白［18］，其中哺乳細(xì)胞中的一些細(xì)胞粘附分子、淋巴細(xì)胞分化抗原、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白等具有一定功能性的蛋白通過(guò)GPI 錨定的形式存于細(xì)胞膜表面［19］，這些蛋白和哺乳動(dòng)物的很多生理過(guò)程息息相關(guān)［20］，然而對(duì)GPI 錨定蛋白的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 可以專(zhuān)一作用于GPI 錨定蛋白的磷脂酰肌醇的磷酸二酯鍵，進(jìn)而使GPI 錨定蛋白從細(xì)胞膜上釋放下來(lái)。表達(dá)和純化高效的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C，從而將其更好地應(yīng)用于對(duì)GPI 錨定蛋白的研究與鑒定中，可為研究GPI 錨定蛋白的生物學(xué)功能等提供有效幫助。由于本實(shí)驗(yàn)中PI-PLC 來(lái)源于蠟狀芽孢桿菌，其結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物體內(nèi)切割GPI 錨定蛋白的酶結(jié)構(gòu)具有相似性，且不作為毒力因子［21］，因此后續(xù)工作可把磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 在細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行應(yīng)用。

圖4 利用PI-PLC 處理膀胱癌細(xì)胞表面的CD59

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了來(lái)源于蠟樣芽孢桿菌的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 基因在大腸桿菌BL21（DE3）中的可溶性表達(dá)。最終該帶有GST 融合標(biāo)簽的重組磷脂酶C 在最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件下發(fā)酵并純化后的質(zhì)量濃度為0.52 mg/mL，比酶活為1322.5 U/mg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所獲PI-PLC 可將GPI 錨定蛋白從細(xì)胞表面釋放下來(lái)。