李建濤 劉憲華 何耀東 汪光義

（1. 天津大學環(huán)境科學與工程學院，天津 300072；2. 天津大學海洋生態(tài)環(huán)境研究中心，天津 300072）

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）是一種ω-3 系列多不飽和脂肪酸，對維持人體的正常生理功能至關重要［1］。DHA 是細胞膜磷脂的組成成分，參與腦細胞和視網膜的正常發(fā)育，具有預防心血管疾病、高血脂等疾病的功效［2］。隨著人們生活水平的不斷提高與對DHA 生物醫(yī)藥價值的認識的不斷深化，DHA 的需求量也不斷上升。2017 年以DHA 為主要產品的ω-3 不飽和脂肪酸的全球銷售額預計可達43 億美元，并在最近5 年內有望保持6.6%的年增長率，市場需求量巨大［3］。魚油是DHA 生產的傳統(tǒng)來源，但其產量受到季節(jié)影響，且漁業(yè)捕撈量有限，難以滿足不斷增長的需求［4］。產DHA 微生物，如破囊壺菌（Thraustochytrium）、裂殖壺菌（Schizochytrium）和隱甲藻（Crypthecodinium）等，具有生長速度快、細胞內DHA 和脂肪酸含量高等優(yōu)勢，可作為DHA 生產的替代來源。據報道，在最適培養(yǎng)條件下，破囊壺菌生物量可高達55.64 g/L，DHA 含量為12.61 g/L［5］；裂殖壺菌的生物量和DHA 可以達到44.09 g/L 和5.25 g/L［6］；寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii）經優(yōu)化補料發(fā)酵培養(yǎng)后，生物量達到60.09 g/L，油脂和DHA 產量分別達28.8 g/L 和11.34 g/L［7］，極具工業(yè)化生產DHA 的潛力。

在發(fā)酵生產DHA 過程中，野生菌種存在著生長退化、適應性差等問題［8］。另外，在這些產油微生物中，DHA 在總油脂中的比例較低。這些因素阻礙了DHA 產業(yè)化生產。傳統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化策略已難再提高DHA 的產量，雖然獲取的生物量已相當可觀，但如果能進一步提高DHA 在總油脂中的比例，培育出DHA 高產微生物新菌株，才能從根本上解決產油微生物中DHA 產量低下的問題。其中誘變育種通過物理、化學和生物手段，引起細胞核堿基缺失、染色體斷裂、基因重組等生物學效應，從而使后代性狀發(fā)生改變，人為引入大量的突變［9-10］。通過篩選，可獲得具有穩(wěn)定產量、適應多樣化發(fā)酵條件的新菌種，提高DHA 產量［11］。因此，本文綜述了誘變育種技術在產油微生物中的應用，提出了篩選獲取新菌株以提高DHA 產量的解決方法，分析了不同誘變育種方式在產油微生物生產DHA 方面的研究現(xiàn)狀，總結出不同誘變育種方式相結合的復合育種思路，希望對今后微生物產DHA 研究有所啟發(fā)。

1 物理誘變

1.1 傳統(tǒng)物理誘變

在物理誘變中使用的高能輻射通常包括電磁輻射（如γ 射線、X 射線和紫外線）和粒子輻射（如快中子和熱中子、離子束、α 和β 粒子）［12］。物理誘變具有操作方便安全、應用范圍廣、突變率高和相對實驗結果比較理想等優(yōu)點，在工業(yè)微生物育種方面得到了廣泛的應用［13］。

國內物理誘變在微藻中較早的研究是利用半導體激光對紫球藻進行照射，發(fā)現(xiàn)合理的誘變時間可以加快紫球藻的生長和提高胞外多糖［14］。之后，越來越多的研究者逐漸把物理誘變技術應用到微生物產DHA 上。一般在使用誘變手段處理時，需要優(yōu)先確定最佳實驗條件、實驗劑量，再定性定量分析突變株的具體成分，復篩得到目的菌株。如佘雋等［15］對寇氏隱甲藻采用60Co-γ 射線輻照誘變時，初篩得到27 株生長速度快、藻體細胞體積大和油脂有明顯增加的突變體。經過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)試驗復篩后，最終獲得一株較出發(fā)藻有明顯優(yōu)勢的突變株。該突變株油脂產量和DHA 產量比出發(fā)株分別提高51.66%和56.92%，DHA 產量為7.14 g/L，含量達到39.04%。呂小義等［16］使用同樣的手段處理裂殖壺菌后，其搖瓶發(fā)酵生物量為47.37 g/L，油脂含量為31.41%，DHA 產量為5.65 g/L，比出發(fā)藻株提高約40%。這些研究結果表明產油微生物經γ 射線誘變照射后，篩選獲得的突變菌株生長速度和細胞形態(tài)大小均優(yōu)于原始菌株，且油脂和DHA 產量也有明顯提高。

與激光和γ 射線等誘變手段相比，離子束誘變具有生理損傷輕、突變幾率高、突變范圍廣等優(yōu)點［17］。Fu 等［18］對裂殖壺菌注入低能離子束，通過蘇丹黑B 染色液（Sudan black B stain）篩選這些突變體，誘變獲得DHA 突變體，其DHA 產量比野生菌株提高了61%。在最佳發(fā)酵條件下，突變株的DHA 產量為6.52 g/L，占總脂肪的46.2%。王芝瑤等［19］對微擬球藻Nannochloropsis oceanicaOZ-1 進行以碳重離子束育種時，也獲得了兩株在生長速度及油脂產率顯著優(yōu)于野生菌株的新突變株。這也是離子束輻射在提高DHA 產量方面取得的有效成果，為揭示離子束誘變機制奠定了研究基礎。

由于突變本身具有不定向性，誘變后會初篩出大量的突變株，如果采用搖瓶發(fā)酵復篩的手段，逐一定量復篩分析目標產物，這會導致工作量繁重且效率低下等問題。因此，有些研究者開始考慮加入特定的定向篩選劑，從而加快目的突變菌株的選育。例如，蔡愷敏［20］報道，在紫外誘變后采用丙二酸（MA）平板、高糖平板培養(yǎng)、低溫培養(yǎng)和紅四氮唑（TTC）活性比較等方法，對突變菌株進行了多輪初篩和復篩，得到了一株遺傳穩(wěn)定性較好且DHA 產量達到10.98 g/L 的裂殖壺菌突變株，比初始菌株提高了23%。許永等［21］通過添加脂肪酸合成的抑制劑喹禾靈，也達到了有效篩選裂殖壺菌突變株的目的。他們從紫外照射后的裂殖壺菌突變菌株中選育出2株DHA 含量高的突變菌株，與對照組相比，DHA分別提高了13.74%和28.75%，突變株的DHA 含量達到脂肪酸的37.28%。相比于直接隨機篩選誘變后的菌種，篩選劑的加入，大大提高了誘變育種的效率和進程［22］。梁園梅等［23］對破囊壺菌紫外誘變后，通過化學藥物喹禾靈和丙二酸脅迫篩選方式，獲得高產突變株，DHA 產量比出發(fā)菌株提高了11.26%，油脂產量提高了41.01%，油脂突變效果顯著。以上研究結果表明在產油微生物中紫外誘變是一種應用最廣泛的方法，因其設備簡單、操作方便及成本低廉，在誘變過程中采取合適的誘變技術尋找能有效篩選突變株的化學藥物，對于獲得高產DHA 的產油微生物至關重要。

1.2 新型ARTP誘變

針對傳統(tǒng)輻射源的突變頻率較低和突變隨機性較大等問題，人們又發(fā)掘和利用了新的誘變技術。其中，常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）新型誘變儀以射頻大氣壓輝光放電（Radio-frequency atmospheric-pressure glow discharge，RF APGD）等離子體射流為核心部件，不僅在設計上有很大的改進，而且具有突變快、突變多樣性高、簡單易行等諸多優(yōu)勢［24］。由于等離子體（Plasma）射流中含有種類豐富的化學活性粒子（如處于激發(fā)態(tài)的He、O、N2、OH 等），可直接或間接作用于細胞內的遺傳物質，造成DNA 分子的斷裂，引起細胞多樣性突變［25］。目前，ARTP 技術已經成功應用在細菌、真菌、微藻等微生物，已成為快速突變微生物基因組的有效方法之一［26］。

ARTP 對DNA 損傷機制具有多樣性，且ARTP的基因損傷效應比紫外和化學突變要更強，會有更多的基因突變位點，獲得突變體的可能性也會越來越高，這就是ARTP 在基因組龐大、代謝網絡復雜的微生物誘變中具有優(yōu)勢的原因［27］。大多數情況下，經ARTP 處理后的突變體篩選也會加入特定的篩選劑。龔定芳等［28］報道在含有碘乙酸、丙二酸及丙二酸-碘乙酸等復合平板上涂布經ARTP 輻射過的裂殖壺菌，篩選出的菌株GC 定量分析得出高產突變體，生物量、油脂總量、DHA 產量與原始菌株相比分別提高了18.11%、14.87%和46.12%，DHA 產量為6.59 g/L。丙二酸可以提供脂肪酸合成的前體物質，玉米醇溶蛋白阻止細胞分裂和繁殖。Zhao 等［29］利用常壓室溫等離子體照射裂殖壺菌后，經丙二酸和玉米醇溶蛋白抗性篩選，得到的突變株DHA 產量增加了1.8 倍，添加微量元素Fe2+后搖瓶培養(yǎng)，可產生14.0 g/L 的DHA。利用ROS 誘導劑2.2′-聯(lián)吡啶可以淘汰掉抗氧化能力較弱的菌株以得到抗氧化能力較強的菌株，這樣篩選出的突變體可能具有較高的DHA 生產能力。袁軍等［30］報道了利用ROS 誘導劑2.2′-聯(lián)吡啶并結合磷酸香草醛快速定性檢測油脂法，最后得到一株DHA 產量比初始菌株提升了29.8%的突變菌株。這些研究結果說明了ARTP 技術對選育高產DHA 微生物具有良好的應用潛力，并且也需要添加有效的篩選劑以增加篩選效率，進一步驗證了篩選劑所具有的重要意義。

目前采用ARTP 對藻類的誘變報道仍然較少，主要集中在對胞內多糖和脂質的研究，但這為后續(xù)藻類誘變產生DHA 提供了可靠的實驗依據。螺旋藻（Spirulina platensis）是一種潛在的通過固定二氧化碳產生多糖的微藻，以往通過物理化學方法均沒有得到碳水化合物含量提高的突變菌株。Fang 等［31］報道經ARTP 處理的螺旋藻有兩株突變株細胞內的碳水化合物分別增加了40.3%和78.0%，突變率和正向突變率分別為45%和25%。ARTP 在寇氏隱甲藻高產脂質方面也已有研究。Liu 等［32］用ARTP 產生突變體后，在含有稀禾定（Sethoxydim）的培養(yǎng)基篩選得到的突變體，生長速度比野生型高24.32%，脂質含量比野生型高7.05%。與野生型菌株相比，突變株中Accase 的酶活性增加了16.15%，轉錄組學分析表明其編碼基因上調了1.53 倍，表明ARTP誘變確實改變了脂肪酸基因的表達。這些研究揭示了誘變可以改變野生型藻種的生化特征，也證明了ARTP 技術對于微藻是一種有效的誘變技術。因此，加強ARTP 在微藻方面的深入研究是未來一段時間內的重點方向，工業(yè)前景潛力巨大。

其他新型物理誘變方式主要包括超高壓、高能電子流、電磁場、熱（溫度）等一系列誘變技術，在微生物誘變育種方面也發(fā)揮著積極的作用，促進生物進化研究和工業(yè)菌種改造，但是在生產DHA 方面還未見報道，所以這些新技術也給未來產油微生物誘變育種開辟了一個新方向。

2 化學誘變

化學誘變劑主要造成DNA 烷基化損傷或者形成堿基化合物，堿性誘變條件下，在內切酶作用、堿基和部分核苷酸切除修復作用以及不穩(wěn)定的DHA 加合物等一系列因素下引起DHA 鏈的斷裂［33］?；瘜W誘變劑種類很多，在誘變育種方面應用較廣泛的有甲基磺酸乙酯（Ethyl methyl sulfonate，EMS）、甲基硝基亞硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）、硫酸二乙酯（Diethyl sulfate，DES）等。

與物理誘變處理方法類似，不同化學誘變劑量的使用也會產生不同的影響。趙愛娟［34］采用濃度為0.1 mol/L 的EMS 對小球藻處理40 min 后，其DHA 含量比對照組提高了72.61%。以相同的方法使用0.1 mol/L 濃度EMS 作用于等鞭金藻，其EPA 和DHA 的含量比對照組提高了1.8 倍和1.4 倍。而當EMS 的濃度為0.2 mol/L 時，不飽和脂肪酸的合成受到抑制，EPA 的含量僅提高31.5%?？梢娺x擇合適的誘變劑濃度對于獲取高產EPA 和DHA 的微藻突變藻種具有重要的影響。陳浩［35］使用MNNG 誘變裂殖壺菌篩選出的突變株生物量達到7.33 g/（L·d），比出發(fā)菌株提高65.09%；DHA 含量達到18.05%，提高49.92%，突變株的經濟性狀優(yōu)于出發(fā)菌株，表明在誘變育種方面MNNG 是良好的化學誘變劑。陳金卿等［36］對雙鞭甲藻進行DES 誘變處理，初篩獲得的菌株經搖瓶復篩和遺傳穩(wěn)定性驗證，發(fā)現(xiàn)與出發(fā)菌株相比，誘變株的DHA 生物合成量達到45.3 g/L，提高4.7 倍，誘變效果大幅提升，具備優(yōu)異的工業(yè)化生產前景。此外，化學誘變劑單獨誘變生產DHA 的研究不多，需要研究者繼續(xù)開發(fā)和探索化學誘變技術，以求應用到更多的產油微生物領域，并且通常情況下會與各種物理誘變方法互相結合。參考物理誘變技術，今后使用化學誘變獲取高產DHA新菌株要考慮篩選劑的重要作用。

3 復合誘變

在之前的產油微生物產DHA 的誘變育種研究中，往往采用單一的誘變方法，這會出現(xiàn)誘變效果差、誘變率低、誘變菌株不穩(wěn)定等一系列問題。近些年，越來越多的研究者嘗試在微生物育種中采用多種誘變技術互相結合的方式，結果表明，復合誘變具有協(xié)同效應，2 種或2 種以上誘變劑和誘變方法的合理搭配使用，誘變效果較單一誘變有顯著的提升［37］。

Lian 等［38］以MNNG 化學誘變和UV 照射物理誘變相結合，提高裂殖壺菌產DHA 的能力。后續(xù)實驗表明，突變體細胞提取物中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸酶和ATP-檸檬酸裂解酶的活性均高于親本菌株，這表明誘變方法能有效地提高裂殖壺菌體內的NADPH 和乙酰輔酶A 的供應。突變株的總脂肪酸中的DHA 比列為56.22%，比親本菌株提高了38.88%，而脂質含量提高了34.84%。王申強［39］通過ARTP-UV 復合誘變，得到了DHA 產量高達11.81 g/L 的突變株，相對于原始菌株提高了75.74%。同時還發(fā)現(xiàn)，突變株的發(fā)酵周期比原始菌株短了12 h，使其在工業(yè)化生產中更具有優(yōu)勢。這表明復合誘變得到的突變株不僅在代謝通路上增加了脂肪酸合成的前體物質，DHA 產量得到了明顯提高，而且也有可能使突變株縮短發(fā)酵周期，經濟效益顯著。

與其他研究者不同的是，趙犇等［40］詳細比較了復合誘變和單因素誘變之間的區(qū)別。他以Schizochxtriumsp.31 為出發(fā)株，進行EMS 和ARTP復合誘變，并將復合誘變方法與2 種單因子誘變方法進行誘變效率、誘變后高產株發(fā)酵特性及遺傳穩(wěn)定性比較。ARTP 方法中，正突變株的數量占總突變株的比列達到60%左右，而EMS 作用下的正負突變株比列相當，證明ARTP 誘變較EMS 誘變有顯著的效果。在2 種單因子誘變方法中，裂殖壺菌突變率差別不大，均介于40%-45%之間，但是EMSARTP 復合誘變后，突變率達到55.7%，明顯高于2種單因子誘變方法。在以DHA 為指標考察時，EMS誘變獲得的DHA 產量僅為5.74 g/L，ARTP 誘變產生的DHA 為6.28 g/L，EMS-ARTP 復合誘變的DHA產量最高，達到了7.16 g/L。由此可見，復合誘變中2 種或2 種以上誘變技術結合得到的突變體不論在DHA 產量上，還是在突變幾率上都比單因子誘變技術有著明顯的優(yōu)勢。

目前，對紫外線與氯化鋰復合誘變的研究多見于微生物產油脂上，在提高DHA 產量方面暫無報道。例如，石婷婷［41］采用紫外線-氯化鋰復合誘變，篩選獲得一株總油脂產量提高了49.06%且遺傳穩(wěn)定的菌株隱球酵母菌（Cryptococcus）。而王婷婷等［42］除利用紫外線-氯化鋰誘變外，還加入了硫酸二乙酯化學誘變方式，對高山被孢霉（Mortierella alpina）進行誘變育種，結果突變株多不飽和脂肪酸花生四烯酸（AA）的產量提高了141%。由于紫外線-氯化鋰復合誘變研究還未涉及DHA 方面，但已有實驗數據顯示在其他產油微生物上取得了較好的效果。這種誘變方式能大大提高總油脂或多不飽和脂肪酸的產量，因此將紫外線和氯化鋰復合誘變技術應用到提高DHA 產量的領域，也是一個值得探索的方向。

4 結語

物理、化學和復合誘變不僅能誘變篩選出高產DHA 新菌株，且大多數情況下獲取的突變體在細胞形態(tài)或生長狀況方面也均優(yōu)于野生菌株，證明誘變育種能很好解決DHA 產量低的問題，同時在創(chuàng)造產油微生物新種質及生物科技領域發(fā)揮重要作用。但仍然存在著突變體篩選效率普遍不高的問題，限制了目的菌株的快速獲取，這就要求建立新的高通量篩選方法，以及不斷探索和尋求更有效的篩選劑。

誘變技術研究產DHA 的微生物多見于裂殖壺菌和破囊壺菌等，而對藻類誘變育種工作起步較晚，主要集中在寇氏隱甲藻、微擬球藻、小球藻、等鞭金藻、雙鞭甲藻等一系列藻種，隨著誘變育種技術的快速發(fā)展，利用藻類生產DHA 的研究也會得到進一步推動。相對于物理和化學誘變，雖然復合誘變具有突變幾率高、適用性強的優(yōu)勢，能夠更有效的選育高產DHA 菌株，但是突變進程仍然是隨機、不定向的，未來可能會開發(fā)出更加先進的誘變育種技術，使微生物定向誘變成為可能，將會大大加速誘變效率，更易獲取目的菌株。