鄒 麗

（四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 611731）

羊胎素膠囊為自制保健品，由綿羊及山羊的胎盤采用現(xiàn)代生物技術(shù)提取加輔料制成，富含卵磷脂、核黃素、抗壞血酸、蛋白質(zhì)、紅細(xì)胞生成素、多肽及氨基酸等多種有效成分，具有促進(jìn)皮膚細(xì)胞生長、補(bǔ)血固本、抗衰老、增活力、提高人體器官免疫力的作用，功效主要有增強(qiáng)免疫[1]、抗氧化[2]、延緩衰老[3]、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥[4]及抗輻射、抗腫瘤[5]。目前，其質(zhì)量控制中僅有關(guān)于氨基酸和微量元素含量的測(cè)定[6-7]，對(duì)總氮的含量測(cè)定鮮有報(bào)道，不能全面反映羊胎素的成分活性。為了全面控制羊胎素的質(zhì)量，本研究中選擇了總氮量作為含量測(cè)定的指標(biāo)成分，并采用凱氏定氮法測(cè)定羊胎素總氮量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DK98-1 型電熱水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，40 kHZ，80 W）；500 mL 凱氏燒瓶；漏斗；石棉網(wǎng)；冷凝管；滴定管；氮?dú)馇?，遠(yuǎn)紅外可控調(diào)溫電爐（成都市聚電器廠BP1810C 型自動(dòng)雙重純水蒸餾器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；BP211D 型Sartorius 電子天平（十萬分之一，德國賽多利斯股份公司）。

1.2 試藥

茚三酮、基準(zhǔn)無水碳酸鈉硫酸鉀、硫酸銅（化學(xué)純，成都化學(xué)試劑廠）；硫酸、氫氧化鈉、無砷鋅、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠等試劑均為分析純；蒸餾水（自制）；羊胎素膠 囊（自 制，批 號(hào) 分 別 為 20170805，20170806，20170807）。

2 方法與結(jié)果

2.1 理化鑒別

取本品內(nèi)容物0.4 g，加水10 mL，浸泡1 h，超聲處理30 min，濾過，取濾液2 mL，加茚三酮試液2 ～3 滴，搖勻，沸水浴加熱5 min，顯藍(lán)色或藍(lán)紫色。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 溶液制備

參照2015 年版《中國藥典（四部）》通則0704 氮測(cè)定法項(xiàng)下第一法（常量法）[8]操作。0.05 mol/L 硫酸滴定液：精密量取硫酸2.7 mL，緩緩注入適量水中，冷卻至室溫，加水稀釋至1 000 mL，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.050 7 mol/L 的硫酸滴定液。40%氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉400 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，即得。2%硼酸溶液：稱取硼酸20 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，即得。甲基紅-溴甲酚綠混合指示液：取0.1%甲基紅的乙醇溶液20 mL，加0.2%溴甲酚綠的乙醇溶液30 mL，搖勻，即得。

2.2.2 消解

取10 粒羊胎素膠囊內(nèi)容物（批號(hào)為20170805），混勻，用濾紙稱取約0.4 g，精密稱定，連同濾紙置干燥的500 mL 凱氏燒瓶中；依次加入硫酸鉀10 g 和硫酸銅粉末0.5 g，再沿瓶壁緩緩加入濃硫酸20 mL；在凱氏燒瓶口放一小漏斗并使凱氏燒瓶成45°傾斜放置，用調(diào)溫電爐緩緩加熱，使溶液的溫度保持在沸點(diǎn)以下，等泡沸停止，調(diào)至強(qiáng)熱至沸騰，待溶液成澄明綠色后，除另有規(guī)定外，繼續(xù)加熱30 min，放冷。

2.2.3 蒸餾

沿瓶壁緩緩加水250 mL，輕輕振搖，混勻，放冷，加40%氫氧化鈉溶液75 mL，注意沿瓶壁流至瓶底，自成一液層，加鋅粒數(shù)粒，用氮?dú)馇驅(qū)P氏燒瓶與冷凝管連接；另取2%硼酸溶液50 mL，置500 mL 錐形瓶中，加甲基紅-溴甲酚綠混合指示液10 滴；將冷凝管的下端插入硼酸溶液的液面下，輕輕擺動(dòng)凱氏燒瓶，使溶液混合均勻，加熱蒸餾，至接收液總體積約為250 mL 時(shí)，將冷凝管尖端提出液面，使蒸氣沖洗約1 min，用水淋洗尖端后停止蒸餾。

2.2.4 滴定

餾出液用硫酸滴定液（濃度為0.050 7 mol/L）滴定至溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛易仙礊榈味ńK點(diǎn)。用空白試驗(yàn)校正（不加樣品，只加試劑，重復(fù)上述操作）。每l mL硫酸滴定液（濃度為0.05 mol/L）相當(dāng)于0.401 mg 的氮。

2.2.5 計(jì)算

根據(jù)中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程氮測(cè)定法[9]測(cè)定?？偟浚╩g/g）= [（V1-V2）×C/0.05×1.401] /M。其中，V1為滴定時(shí)供消耗硫酸滴定液的體積（mL），V2為空白試驗(yàn)中消耗硫酸滴定液的體積（mL），C為硫酸滴定液的濃度（mol/L），M為供試品取樣量（g）。

2.2.6 方法學(xué)考察

專屬性考察：取羊胎素膠囊的陰性對(duì)照樣品（僅含空白輔料），按總氮量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照樣品無干擾。

線性關(guān)系考察：取羊胎素膠囊（批號(hào)為20170805）的內(nèi)容物適量，按總氮量測(cè)定方法測(cè)定，以取樣量為（X）橫坐標(biāo)、總氮量為（Y）縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程Y=176.58X-2.8476，r=0.999 2（n=6）。結(jié)果表明，羊胎素膠囊取樣量在0.119 54 ～1.084 31 g 范圍內(nèi)與總氮量線性關(guān)系良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取羊胎素膠囊（批號(hào)為20170807）的內(nèi)容物5 份，每份約0.4 g，精密稱定，按總氮量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算總氮量。結(jié)果羊胎素膠囊平均總氮量為73.05 mg/g，RSD為0.65% （n=5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取羊胎素膠囊（批號(hào)為20170805，含氮量為70.93 mg/g）的內(nèi)容物共5 份，每份約0.2 g，精密稱定，分別置干燥的500mL 凱氏燒瓶中，再依次精密加硫酸銨0.165 g，按上述試驗(yàn)步驟操作，測(cè)定含氮總量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 硫酸銨加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.7 樣品含量測(cè)定

取3 批羊胎素膠囊內(nèi)容物各20 粒，按批號(hào)混勻，分別取約0.4 g，精密稱定，按上述方法測(cè)定含量（平行測(cè)定2 份）。結(jié)果見表2。

表2 3 批樣品總氮量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）

3 討論

凱氏定氮法的原理是將含氮有機(jī)物在硫酸及催化劑的作用下，經(jīng)分解后的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨，故加樣回收試驗(yàn)的對(duì)照物質(zhì)為硫酸銨。在試驗(yàn)過程中，應(yīng)注意樣品放入凱氏燒瓶中時(shí)應(yīng)避免使其粘附在瓶頸部；消解過程中應(yīng)均勻轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，避免該樣品未消解完全而造成氮損失；保證蒸餾中不能停止加熱，防止液體倒吸。

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，常見的總氮量測(cè)定方法不多。嚴(yán)志強(qiáng)等[10]采用紫外分光光度法測(cè)定了茶薪菇中總氮的含量，但該方法對(duì)分析試驗(yàn)環(huán)境、玻璃器皿的潔凈度等因素要求較高。韋鋒等[11]采用了分散非紅外法測(cè)定了水中的總氮量，但該方法僅適用于測(cè)定水樣中的總氮量。王鍵等[12]采用了近紅外光譜分析法測(cè)定了復(fù)合肥的總氮量。劉豐奎等[13]采用的是氣相分子吸收光譜法測(cè)定水溶肥中的總氮量。這2 種方法的分析速度快，效率高，但常用于化肥和水質(zhì)中總氮量的測(cè)定，其成本高，在食品與藥品中罕有使用。

目前，測(cè)定食品及藥品中總氮量常用方法仍為凱氏定氮法，操作過程雖煩瑣，但對(duì)總氮量的測(cè)定成本低、普適性較強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣。特別是近幾年來，凱氏定氮法對(duì)硝基、偶氮、雜環(huán)等類化合物也可得到準(zhǔn)確的結(jié)果，能用于所有動(dòng)植物樣品的分析[14-17]，迄今仍作為《中國藥典》法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。