陳曉嘉 ，周芳梅 ，鐘舒潔 ，李志龍 ，馮志強(qiáng)

1. 廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站（廣州 510308）；2. 廣東省食品工業(yè)研究所有限公司（廣州 510308）；3. 廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室（廣州 510308）

黃曲霉毒素由真菌黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生，主要有4種：AFTB1，AFTB2，AFTG1和，是自然界已發(fā)現(xiàn)的理化性質(zhì)最穩(wěn)定的真菌毒素，有很強(qiáng)的毒性、致癌性和致畸毒性[3]。1993年，世界衛(wèi)生組織將黃曲霉毒素劃定為Ⅰ類致癌物質(zhì)[4]。中國(guó)是茶葉生產(chǎn)、出口和消費(fèi)大國(guó)，茶葉安全問題深受社會(huì)關(guān)注，近年來更是流傳“普洱茶致癌說”，安全問題已演變?yōu)槠斩枭a(chǎn)、流通領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。目前黃曲霉毒素檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[5-6]、薄層色譜法[7]、高效液相色譜（FLD）[8]、液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法[9]。ELISA、HPLC法檢測(cè)普洱茶中四種黃曲霉毒素均存在假陽性，GB 5009.22—2016中液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法適用基質(zhì)不包含茶葉類別。

試驗(yàn)采用免疫親和柱進(jìn)行凈化處理，UPLC-MS/MS法測(cè)定普洱茶中AFTB1，AFTB2，AFTG1和AFTG2的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器

Triple Quad 3500超高液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；Turbo Vap LV 50位自動(dòng)氮吹濃縮儀（瑞典Biotage公司）；AG204電子分析天平（瑞士Mettler Toledo）；KQ-500DE超聲波清洗儀（昆山牌）；CF15 RXII高速冷凍落地式離心機(jī)（日立）；特異性免疫親和柱（美國(guó)Romer Labs公司）。

1.2 材料與試劑

黃曲霉毒素混標(biāo)（純度98%，美國(guó)O2SI公司，ATFB1，ATFB2，ATFG1和ATFG2濃度分別為0.999 6，0.300 2，0.999 6和0.305 5 mg/L）。

乙腈（色譜純，默克）；氯化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；十二水磷酸氫二鈉（分析純，天津市化學(xué)試劑一廠）；磷酸二氫鉀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；氯化鉀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；吐溫-20（分析純，阿法埃莎（天津）化學(xué)有限公司）；甲醇（分析純，天津市化學(xué)試劑一廠）。

1.3 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μ m），流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水，梯度洗脫，見表1；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量10.0 μL；柱溫40 ℃。

表1 黃曲霉毒素流動(dòng)相洗脫梯度

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI+），正離子掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），電噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度為550 ℃，氣簾氣（CUR）壓力為38 psi，霧化器壓力（GAS1）為55 psi，輔助加熱器壓力（GAS2）為60 psi。黃曲霉毒素AFTB1，AFTB2，AFTG1和AFTG2的其他相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2 黃曲霉毒素目標(biāo)物選擇反應(yīng)檢測(cè)優(yōu)化參數(shù)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液配制

準(zhǔn)確移取1.0 mL混標(biāo)溶液于100 mL容量瓶中，加50%甲醇水稀釋配制成儲(chǔ)備液（AFTB1和AFTG1的質(zhì)量濃度為10 ng/mL，AFTB2和AFTG2的質(zhì)量濃度為3 ng/mL），精確移取0.01，0.05，0.1，0.2，0.5和0.8 mL儲(chǔ)備液于1.0 mL容量瓶中，用50%甲醇水稀釋定容，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液（其中0.01 mL僅含AFTB1和AFTG1），AFTB1和AFTG1曲線質(zhì)量濃度為0.1，0.5，1，2，5和8 ng/mL，AFTB2和AFTG2曲線質(zhì)量濃度為0.15，0.3，0.6，1.5和2.4 ng/mL。

1.6 樣品處理

1.6.1 樣品制備

取500 g普洱茶樣品，經(jīng)高速粉碎機(jī)磨細(xì)后過20目篩備測(cè)，取5.0 g待測(cè)樣品加入25 mL 70%甲醇水溶液進(jìn)行提取，超聲30 min，以10 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液，加入12 mL吐溫溶液，旋渦1 min，待測(cè)。

1.6.2 樣品凈化

樣品待測(cè)液以1 mL/min流速全部通過特異性免疫親和柱，先用5 mL PBS溶液和5 mL水以1 mL/min流速淋洗親和柱去掉雜質(zhì)，再用2 mL甲醇洗脫，抽干親和柱，收集全部洗脫液至試管中，在50 ℃下用氮?dú)鈱⑾疵撘捍抵两?，?0%甲醇水定容至1.0 mL，旋渦1 min復(fù)溶，用微孔過濾膜（0.2 μ m）壓濾后進(jìn)樣上機(jī)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取液的優(yōu)化

對(duì)于茶葉的前處理，首先要加提取液進(jìn)行浸泡超聲提取毒素，黃曲霉毒素極性大，試驗(yàn)提取液體系選擇了以甲醇-水（體積比為30︰70，50︰50和70︰30）和乙腈-水（體積比為30︰70，50︰50和70︰30）為提取劑對(duì)樣品進(jìn)行提取，檢測(cè)含量，計(jì)算回收率，回收率結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，甲醇-水（體積比70︰30）和乙腈-水（體積比70︰30）的提取效率最高，回收率均在80.3%以上。乙腈毒性較大，故試驗(yàn)選擇了甲醇-水（體積比70︰30）作為提取劑。

圖1 不同提取液體系回收率

2.2 樣品凈化的優(yōu)化

試驗(yàn)同時(shí)選用了多功能凈化柱與免疫親和柱對(duì)凈化效果做比對(duì)，使用多功能凈化柱進(jìn)行凈化測(cè)定普洱茶中的4種黃曲霉毒素的加標(biāo)回收率在101%～135%之間，使用免疫親和柱進(jìn)行凈化測(cè)定普洱茶中的黃曲霉毒素的加標(biāo)回收率在80.3%～116%之間。經(jīng)多功能凈化柱凈化后的樣品仍有明顯的基質(zhì)干擾，凈化效果不理想，導(dǎo)致含量偏高。多功能凈化柱操作方便快捷，但不如免疫親和柱的特異性顯著，能有效吸附雜質(zhì)；多功能凈化柱適用于簡(jiǎn)單基質(zhì)的樣品，對(duì)于茶葉這種基質(zhì)復(fù)雜的樣品，免疫親和柱更為適用。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)選擇了Waters ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）為分離柱，在正離子模式下，流動(dòng)相中加入0.1%甲酸水溶液，有利于化合物的離子化。大多數(shù)真菌毒素易溶于甲醇和乙腈等有機(jī)試劑。流動(dòng)相分別選擇甲醇和乙腈做比對(duì)。結(jié)果證明，選擇甲醇作流動(dòng)相時(shí)，色譜分離效果比乙腈好，但是離子化程度受抑制，離子響應(yīng)值下降，靈敏度較低；乙腈的離子化程度高于甲醇，離子響應(yīng)值較高，靈敏度增高，因此采用0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。經(jīng)過優(yōu)化，確定了流動(dòng)相比例和梯度條件，優(yōu)化后的流動(dòng)相洗脫梯度見表1。

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)以0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，對(duì)4種黃曲霉毒素進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，選用MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)4種黃曲霉毒素，4種黃曲霉毒素在正離子模式下獲得[M+H]+的響應(yīng)值最大，通過母離子掃描模式，確定母離子去簇電壓最優(yōu)參數(shù)，再通過子離子模式，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞電壓，選擇響應(yīng)最佳的子離子用于定量，優(yōu)化后的MRM條件見表2。

2.5 質(zhì)譜結(jié)果

圖2 4種黃曲霉毒素的MRM離子圖

取標(biāo)樣溶液（含80 ng/mL AFTB1和AFTG1，24 ng/mL AFTB2和AFTG2）上機(jī)分析，AFTB1，AFTB2，AFTG1和AFTG2的 MRM離子圖如圖2所示。

2.6 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限

以待測(cè)黃曲霉毒素定量離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性關(guān)系考察。黃曲霉毒素B1和G1在0.1～8 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 4～0.999 6；黃曲霉毒素B2和G2在0.15～2.4 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 0～0.999 1，具體見表3。

取陰性樣品，加入標(biāo)液，同樣品處理方法制備、測(cè)定，以3倍信噪比確定檢出限（LOD），以10倍信噪比計(jì)算方法確定定量限（LOQ）。黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2的檢出限（LOD）均為0.25 μg/kg，定量限（LOQ）分別為0.60，0.60，0.60和0.80 μg/kg，具體見表3。

2.7 精密度

取陰性樣品，加入適當(dāng)?shù)南♂尰旌蟽?chǔ)備液，最終含量分別為：AFTB1和AFTG150 μg/kg；AFTB2和AFTG215 μg/kg。樣品處理方法平行制備6份，進(jìn)行4種黃曲霉毒素精密度測(cè)試。黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2的RSD（n=6）分別為2.7%，3.4%，2.4%和3.6%，具體見表3。

表3 4種黃曲霉毒素線性關(guān)系、檢測(cè)限、定量限和重復(fù)性

2.8 方法回收率

取陰性樣品，分別加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，最終加標(biāo)含量成低、中、高3個(gè)濃度，每個(gè)濃度各測(cè)6次。分別在5 g樣品中加入適量的混合標(biāo)液，使AFTB1和AFTG1含量分別為0.25，5和20 ng/g，AFTB2和AFTG2含量分別為0.75，1.5和6 ng/g，同樣品處理方法制備，檢測(cè)含量，其回收率為80.3%～116.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5.2%，具體見表4。

2.9 檢測(cè)方法的對(duì)比和分析

目前檢驗(yàn)黃曲霉毒素的常用檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、薄層色譜法（TLC）、免疫親和柱凈化-柱后衍生化-高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法。試驗(yàn)選用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫親和柱凈化-柱后衍生化-高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法（HPLC-FLD）與所建立的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）三種方法對(duì)普洱茶中4種黃曲霉毒素進(jìn)行方法比對(duì)檢測(cè)，方法比對(duì)結(jié)果見表5。ELISA法與HPLC-FLD法檢測(cè)普洱茶中的黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2含量均出現(xiàn)假陽性結(jié)果。由于茶葉含有酚類物質(zhì)，故不適用于ELISA法檢測(cè)黃曲霉毒素。HPLC-FLD方法主要用分析物的保留時(shí)間作定性依據(jù)，茶葉基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)中的組分與分析物極性相似，導(dǎo)致保留時(shí)間相似，故有誤判，因此HPLCFLD方法不適用于檢測(cè)普洱茶中的4種黃曲霉毒素。

UPLC-MS/MS方法采用分析物的保留時(shí)間和離子對(duì)作為定性依據(jù)，不存在誤判。因此在分析物定性方面，UPLC-MS/MS方法優(yōu)于HPLC-FLD方法，樣品經(jīng)過特異性免疫親和柱后，在MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，可有效屏蔽茶葉的復(fù)雜基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的凈化，能準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)茶葉中的4種黃曲霉毒素含量，有效地避免假陽性或者假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。免疫親和凈化-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，有助于提高分析效率，降低成本，為茶葉中4種黃曲霉毒素含量的測(cè)定提供參考。

表4 4種黃曲霉毒素回收率和重復(fù)性

表5 三種檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法測(cè)定普洱茶中黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2的方法。普洱茶樣品經(jīng)甲醇-水（70︰30，V/V）提取后，采用免疫親和柱凈化樣品提取液，減少樣品雜質(zhì)的干擾。試驗(yàn)分別對(duì)樣品前處理方法、色譜條件、質(zhì)譜條件進(jìn)行了比較和優(yōu)化，所建立的方法操作簡(jiǎn)單，回收率和精密度高，靈敏度高，解決了原有方法測(cè)定普洱茶中黃曲霉毒素假陽性的問題。該方法適用于普洱茶中黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2的檢測(cè)。