寧芊，韋航，陳美卿，方靈，史夢(mèng)竹，傅建煒*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院（福州 350002）；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（福州 350002）

中國(guó)是茶的故鄉(xiāng)，茶葉作為一種具有資源優(yōu)勢(shì)、保健功效、文化底蘊(yùn)和消費(fèi)傳統(tǒng)的特色農(nóng)產(chǎn)品，深受全球消費(fèi)者的歡迎[1]。茶葉中的芳香物質(zhì)是指茶葉中發(fā)揮物質(zhì)的總稱，茶葉中香氣成分的含量雖然都很少，一般只占干物質(zhì)的0.01%～0.05%，但其種類卻非常復(fù)雜且對(duì)形成茶香起到重要作用[2]，是決定茶葉品質(zhì)的決定性因素。據(jù)分析，通常茶葉含有的香氣成分化合物達(dá)到300余種，鮮葉中香氣成分的化合物有50種。

不同年份的茶葉，其主要成分會(huì)發(fā)生改變，其中香氣成分也有所變化。一般當(dāng)茶葉存放超過(guò)2年，茶的香氣基本散失殆盡。但白茶卻不同，白茶主產(chǎn)于福建，為中國(guó)特有的茶類。經(jīng)過(guò)萎凋和干燥后，造就成茶外表滿披白毫，湯色清淡且淺黃明亮，滋味鮮醇或清甜，且伴有毫香的獨(dú)特品質(zhì)特征。與其他茶葉相比，白茶存放時(shí)間越長(zhǎng)，其藥用價(jià)值越高，有“一年茶，三年藥，七年寶”的說(shuō)法[3-4]。隨著貯藏年份增加，當(dāng)年新白茶獨(dú)有“毫香蜜韻”呈杏花香，存放3～8年后則呈荷葉香，8～15年轉(zhuǎn)為棗香，15年以上則呈琥珀沉香。

采用現(xiàn)代儀器分析手段詳細(xì)研究福建白茶的特征香氣物質(zhì)，識(shí)別出主要香氣特征化合物，研究不同等級(jí)和不同年份的白茶香氣物質(zhì)的共同點(diǎn)和區(qū)別之處，對(duì)于豐富茶葉的香氣分析技術(shù)，完善茶葉香氣化學(xué)理論，對(duì)改善和提高茶葉的香氣品質(zhì)等均具有重要意義[5]。祁丹丹等[6]利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析快速陳化和自然陳化白茶香氣上的差異，劉琳燕等[7]、王力等[8]采用頂空固相微萃取后，經(jīng)GC-MS鑒定不同年份白茶的香氣成分，結(jié)果表明：頂空固相微萃取的結(jié)果在眾多茶葉揮發(fā)性化合物測(cè)定中與感官審評(píng)的結(jié)果最為接近，但是它對(duì)萃取溫度和萃取時(shí)間的依賴性很大。但目前對(duì)于白茶香氣物質(zhì)檢測(cè)條件的優(yōu)化研究，尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

試驗(yàn)通過(guò)調(diào)整不同的檢測(cè)條件，得到最優(yōu)頂空固相微萃取-氣相串聯(lián)質(zhì)譜（HS-SMPE-GC-MS/MS）檢測(cè)方法，并應(yīng)用于檢測(cè)不同年份不同等級(jí)福建白茶的香氣物質(zhì)之間的區(qū)別，旨在提高白茶香氣檢測(cè)的精準(zhǔn)度及陳年白茶香氣組成研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

不同年份的白茶：2014年一級(jí)牡丹、2015年一級(jí)牡丹、2016年一級(jí)牡丹、2007年高級(jí)牡丹、2012年高級(jí)牡丹、2007年特級(jí)牡丹、2017年特級(jí)牡丹。

1.2 儀器與設(shè)備

島津GCMS-TQ8040氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀；固相微萃取裝置，SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）和萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）；恒溫水浴鍋（朗越SYG-2，常州朗越儀器）；鐵架臺(tái)（揚(yáng)州美家臣連教儀器廠）；40 mL透明頂空萃取瓶（Agilent RAISE）；40 mL樣品瓶白色開(kāi)口蓋（RAISE）；含本色PTFE/本色硅膠墊；分析天平（AB204-5）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 萃取頭的老化

將固相萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口250 ℃老化20 min，除去可能殘留在萃取頭的吸附物。GC-MS進(jìn)樣檢測(cè)，檢測(cè)萃取頭沒(méi)有吸附茶葉香氣的本底值，驗(yàn)證萃取頭是否老化完全。

1.3.2 檢測(cè)的條件優(yōu)化

1.3.2.1 水浴吸附溫度的優(yōu)化

保持其他檢測(cè)條件不變，在不同水浴吸附溫度（30，50，70和90 ℃）下考察茶葉香氣的物質(zhì)檢測(cè)情況，對(duì)比其出峰的數(shù)量和峰面積大小。

1.3.2.2 水浴吸附時(shí)間的優(yōu)化

保持其他檢測(cè)條件不變，在不同水浴吸附時(shí)間（15，30，45，60和90 min）下考察茶葉香氣的物質(zhì)檢測(cè)情況，比較其出峰的數(shù)量和面積大小。

1.3.2.3 GC-MS升溫程序的優(yōu)化

保持其他檢測(cè)條件不變，在不同氣相升溫程序下茶葉香氣的物質(zhì)檢測(cè)情況，對(duì)比其色譜峰分離程度和峰面積大小。

1.3.2.4 GC-MS氣相色譜條件進(jìn)樣優(yōu)化

保持其他檢測(cè)條件不變，在不同的進(jìn)樣方式下（不分流、分流）及不同分流比進(jìn)樣的條件下考察茶葉香氣的物質(zhì)檢測(cè)情況，對(duì)比其色譜峰分離程度和峰面積大小。

1.3.3 茶葉香氣萃取試驗(yàn)方法

試驗(yàn)前將固相微萃取頭置于氣相色譜儀進(jìn)樣口，經(jīng)270 ℃老化15～20 min備用，稱取3 g干茶樣于40 mL頂空萃取瓶中，加蓋密封。于恒溫水浴鍋中恒溫水浴一定時(shí)間，使其達(dá)到氣-液平衡。將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，萃取一定時(shí)間，將萃取頭取出，插入氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣口，立即對(duì)所富集的香氣進(jìn)行3 min解析，然后運(yùn)氣GC-MS進(jìn)行香氣物質(zhì)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水浴萃取溫度的優(yōu)化

香氣物質(zhì)進(jìn)入固定相的平衡時(shí)間與萃取的溫度選擇有關(guān)系，因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)妮腿囟葪l件，使其在合理的時(shí)間范圍、GC-MS檢測(cè)條件下能獲得滿意的靈敏。萃取溫度分別為30，50，70和90 ℃時(shí)，香氣成分的出峰情況如圖1（a）～（d）所示。30 ℃時(shí)茶葉香氣出峰的數(shù)量和峰面積比較小，隨著萃取溫度逐漸升高，茶葉香氣的出峰數(shù)量明顯增加，峰面積也有所變化，10～18 min的峰面積隨著溫度升高而逐漸減小，18～43 min的峰面積隨著溫度升高而逐漸增大，90 ℃條件下，10～25 min的峰有所減少，并且重復(fù)性差，不穩(wěn)定，綜合考慮選擇70 ℃水浴進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 不同水浴吸附溫度下茶葉香氣成分色譜圖

2.2 水浴萃取時(shí)間的優(yōu)化

要使頂空、吸附薄膜和茶葉三相中物質(zhì)均衡分配，并且保持在一定的平衡狀態(tài)。分析物成分在三相中達(dá)到平衡所需要的時(shí)間即為在水浴中的萃取時(shí)間。萃取時(shí)間分別為15，30，45，60和90 min時(shí)的香氣成分的出峰情況如圖2所示。萃取吸附時(shí)間對(duì)茶葉香氣成分的出峰情況有所影響，吸附時(shí)間越長(zhǎng)，香氣成分附著在萃取針就越多，但前面吸附的成分會(huì)脫附。經(jīng)過(guò)比較在60和90 min時(shí)的出峰較多，響應(yīng)值較好。萃取60 min，出峰數(shù)量達(dá)到最多，峰面積也達(dá)到最大，化合物的種類含量的萃取量達(dá)到最大值。隨著水浴時(shí)間增加，大分子化合物出峰時(shí)間向后推移且萃取值相對(duì)減小，萃取時(shí)間對(duì)萃取量的影響有所不同。綜合其色譜峰數(shù)量和峰面積大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸附萃取60 min的圖譜最佳。故選擇水浴萃取時(shí)間60 min。

圖2 水浴溫度下不同吸附時(shí)間茶葉香氣成分色譜圖

2.3 氣相升溫程序的優(yōu)化

氣相質(zhì)譜檢測(cè)條件是：DB-5MS氣相毛細(xì)管柱（30 m，0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣時(shí)間1 min，分流進(jìn)樣，柱流速1 mL/min，質(zhì)譜接口溫度280 ℃，離子源溫度200 ℃，質(zhì)譜掃描范圍m/z35～550。

通過(guò)改變不同的升溫程序，確定條件為：起始柱溫40 ℃保持2 min，3 ℃/min升溫到170 ℃，以20 ℃/min升溫到270 ℃，保持2 min?？偣?3.50 min，在此條件下能使色譜峰的分離度達(dá)到最佳。相應(yīng)色譜圖如圖3所示。

2.4 氣相色譜分流比的優(yōu)化

分流比就是樣品進(jìn)到進(jìn)樣口后汽化產(chǎn)生的氣體，進(jìn)入色柱與排出進(jìn)樣的比例。因?yàn)闃悠菲a(chǎn)生的氣體不可能完全進(jìn)入色譜柱，進(jìn)行分離，再進(jìn)入測(cè)器檢測(cè)，一方面原因在于色譜柱的載樣量不是無(wú)限大，過(guò)多的樣品進(jìn)入色譜柱會(huì)超載，造成分離效能下降，峰變形拖尾，還會(huì)影響到使用壽命；另一方面，色譜柱比較細(xì)，樣品汽化產(chǎn)生氣體膨脹后，不可能瞬間進(jìn)入色譜柱，需要一定的時(shí)間，但又需要控制時(shí)間的長(zhǎng)度，否則譜帶會(huì)變寬。通過(guò)不同的分流比來(lái)選擇合適的測(cè)試條件（分流比1︰1，1︰2和1︰5），出峰情況如圖12～圖14所示。分流比在1︰1和1︰2時(shí)的出峰情況比較好，綜合考慮選擇分流比1︰2的測(cè)試條件。

2.5 不同年份白茶（特級(jí)牡丹、高級(jí)牡丹、一級(jí)牡丹）香氣成分分析比較

2.5.1 不同年份特級(jí)牡丹香氣成分的差異

從圖5的（a）和（b）可以看出特級(jí)牡丹香氣化合物質(zhì)總體的變化規(guī)律是隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，物質(zhì)增加，大部分香氣物質(zhì)減少，部分香氣物質(zhì)增加，并且增加比較明顯。

2017年特級(jí)牡丹的主要香氣成分有116種，其中醛類16種、酯類9種、酮類18種，碳?xì)漕?6種、醇類15種、其他類12種；醇類化合物占色譜峰面積的34.8%。2007年特級(jí)牡丹中測(cè)得的主要香氣成分有100余種。測(cè)得的特級(jí)牡丹的主要香氣成分有芳樟醇、苯甲醛、苯乙醇、氧化芳樟醇、甜樺油、苯甲醇、β-紫羅酮、4, 6-二甲基十二烷、壬醛、十二烷、4-[2, 2, 6-三甲基-7-氧雜二環(huán)[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮、1-十六烯、十四烷、二氫獼猴桃內(nèi)酯、正己醛、咖啡因、2,6, 10-三甲基十三烷、2-己烯醛、反式-氧化芳樟醇、2-己基-1-癸醇、棕櫚酸甲酯、N-乙基琥珀酰亞胺。

圖4 不同分流比下茶葉香氣成分色譜圖

圖5 不同年份特級(jí)牡丹香氣色譜圖

從所檢測(cè)的數(shù)據(jù)中可得，2007年比2017年香氣成分含量大部分減少，其中芳樟醇含量最大，減少量也最多，由23.53%降到5.89%，10年降低將近5倍，含量排名第二的苯甲醛也由原先的6.27%下降至1.47%，而2007年的β-紫羅酮?jiǎng)t較2017年下降92.6%，為所有主要香氣中下降最多的成分。但也有一部分香氣成分含量增加，如苯乙醇、苯甲醇、壬醛、咖啡因、2, 6,10-三甲基十三烷、反式-氧化芳樟醇、2-己基-1-癸醇、棕櫚酸甲酯、N-乙基琥珀酰亞胺等。其中，N-乙基琥珀酰亞胺、棕櫚酸甲酯和咖啡堿，10后的含量分別為2007年的8.2，2.5及2.3倍。

2.5.2 不同年份高級(jí)牡丹香氣成分的差異

對(duì)于高級(jí)牡丹來(lái)說(shuō)，檢測(cè)出的前20的香氣成分含量大部分在隨著儲(chǔ)存時(shí)間增加而減少。2012年的高級(jí)牡丹，含量最高的是苯乙醇，占總體的6.33%，而在2007年中含量最高的是4, 6-二甲基十二烷（5.45%），醇類總量由2012年的22.41%下降為2007年的8.4%，而碳?xì)漕惪偭縿t由2012年的6.86%上升至2007年的10.32%，這可能與白茶貯藏陳化過(guò)程發(fā)生的變化有關(guān)。也有一小部分含量在增加，如4, 6-二甲基十二烷、咖啡因、N-乙基琥珀酰亞胺、壬醛、3, 7-二甲基癸烷等。其中，具有月下香及紫羅蘭香氣的2-己基十二醇和具有溫和的柏木香氣的柏木腦分別為2012年的8.9倍和2.6倍。

圖6（a）和（b）中高級(jí)牡丹香氣化合物質(zhì)總體的變化規(guī)律是隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，物質(zhì)由大變小。高級(jí)牡丹的主要香氣成分有苯甲醇、苯乙醇、氧化芳樟醇、苯甲醛、4, 6-二甲基十二烷、咖啡因、二氫獼猴桃內(nèi)酯、N-乙基琥珀酰亞胺、反式-氧化芳樟醇、壬醛、順-Α, Α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、3-甲基十一烷、棕櫚酸甲酯、苯乙醛、3, 7-二甲基癸烷、二環(huán)己基甲酮、2-己基十二醇、5-(2-甲基丙基)壬烷、2, 4-二叔丁基苯酚、柏木腦。

圖6 不同年份高級(jí)牡丹香氣色譜圖

2.5.3 不同年份一級(jí)牡丹香氣成分的差異

不論是2016年還是2014年，一級(jí)牡丹香味成分中含量最高且種類最多，均為碳?xì)浠衔?，分別占總香氣成分物質(zhì)的19.51%和15.39%，這與之前特級(jí)牡丹和高級(jí)牡丹的檢測(cè)結(jié)果稍有區(qū)別，也反映出不同等級(jí)批次的白茶在香氣的組成比例上存在一定差異，這也是區(qū)別不同品級(jí)白茶的關(guān)鍵所在。雖然年份相隔不遠(yuǎn)，但經(jīng)過(guò)2年存放，特級(jí)和高級(jí)牡丹中均存在的N-乙基琥珀酰亞胺和一級(jí)牡丹特有的帶有土壤氣味的3, 5-辛二烯-2-酮消失。但3-甲基十一烷、反式-氧化芳樟醇、苯甲醇、4, 6-二甲基十二烷等卻有所增加。特別是苯甲醇，2014年較2016年增加4.4倍。

圖7（a）和（b）的一級(jí)牡丹香氣化合物質(zhì)總體的變化規(guī)律是隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，物質(zhì)由少變多又變少。2016年的一級(jí)牡丹香氣物質(zhì)比2014年的大得多。一級(jí)牡丹的主要香氣成分有十二烷、咖啡因、苯甲醛、十四烷、芳樟醇、壬醛、苯乙醇、2, 6, 10-三甲基十五烷、2, 3a-二甲基六氫茚滿-苯并呋喃、氧化芳樟醇、β-紫羅酮、2-溴十二烷、二氫獼猴桃內(nèi)酯、3-甲基十一烷、N-乙基琥珀酰亞胺、反式-氧化芳樟醇、棕櫚酸甲酯、苯甲醇、4, 6-二甲基十二烷、2, 4-二叔丁基苯酚、3, 5-辛二烯-2-酮、甜樺油、4-[2, 2,6-三甲基-7-氧雜二環(huán)[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮。

圖7 不同年份一級(jí)牡丹香氣色譜圖

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)研究在不同萃取溫度和萃取時(shí)間下頂空微萃取對(duì)白茶香味物質(zhì)的富集效果，結(jié)果表明，在70 ℃萃取溫度下持續(xù)萃取60 min，其萃取效果最佳；GC-MS最優(yōu)分析條件為：手動(dòng)進(jìn)樣，分流比1︰2；進(jìn)樣口溫度250 ℃，GM-MS接口溫度250 ℃；升溫程序：起始柱溫40 ℃保持2 min，以4 ℃/min升至170 ℃保持1 min，后再以20 ℃/min升至270 ℃，保持2 min。

白茶的儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)茶葉香氣成分有很大的影響，含量會(huì)發(fā)生明顯的變化。隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，茶葉香氣中的成分含量會(huì)發(fā)生改變，有的香氣成分會(huì)減少甚至消失，如醇類化合物均有不同程度的降低，其他香氣成分如花果香型的芳樟醇及其氧化物[9-11]，有微弱蘋(píng)果香氣的苯甲醛，具有柔和玫瑰花香的苯乙醇[12]，有紫羅蘭和木香香氣的β-紫羅酮[13]，有麝香氣息混合香豆素的二氫獼猴桃內(nèi)酯[14]等白茶中的主要香氣成分降低或是分解，使白茶清鮮、毫香感逐漸減少甚至消失。但有的香氣成分含量會(huì)增加，如咖啡因，白茶中只有一級(jí)牡丹的咖啡因含量隨著茶葉年份增加而降低，而特級(jí)牡丹和高級(jí)牡丹則是茶葉年份越久，咖啡因含量越高。此外，碳?xì)浠衔铮貏e是烯類，也有不同程度增加，這可能是白茶貯藏陳化過(guò)程中的一個(gè)特點(diǎn)。所檢測(cè)的烷烴類物質(zhì)雖無(wú)芳香氣味，但可能是通過(guò)與其他香氣物質(zhì)的互作效應(yīng)從而間接促進(jìn)香氣的形成[15]。白茶中的主要香氣成分與相關(guān)研究基本相同，但若干香氣成分的結(jié)果有所偏差，可能是因?yàn)樗刹枞~在制作的過(guò)程、儲(chǔ)存條件、儲(chǔ)存時(shí)間上的差異，或是試驗(yàn)操作過(guò)程中的一些偏差所致。