楊雅焯，汪 迎，李 輝，莊 靜

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095)

六堡茶是一種后發(fā)酵緊壓茶，具有獨特的檳榔香味，因“紅、濃、陳、醇”的風(fēng)味品質(zhì)和清血管、助消化、降“三高”等保健功能而得到國內(nèi)外愛茶人士的認可[1-2]。沱茶有別于其他茶類，屬再加工茶中的緊壓茶，為重慶和云南特有，主要分為云南沱茶、普洱沱茶和重慶沱茶3種。重慶沱茶一般選用中上等曬青、烘青和炒青毛茶為原料，然后進行搭配、篩分、整形、拼堆、稱料、蒸壓成型、干燥等工序，其成品茶形似碗臼，色澤烏黑油潤，湯色澄黃明亮，滋味醇厚甘和[3]。

緊壓茶的后發(fā)酵過程里，由于溫度、濕度等原因，微生物大量生長繁殖。這些微生物在代謝活動中，為了滿足自己對碳、氮的需求，會分泌胞外酶，分解、轉(zhuǎn)化和降解纖維素、果膠等茶葉內(nèi)含物，從而形成緊壓茶的獨特滋味成分[4]。六堡茶特有色香味的形成，就是蛋白質(zhì)、茶多酚等物質(zhì)在發(fā)酵過程中，由于水分、溫度及有益微生物的綜合作用，發(fā)生水解、糖解和氧化聚合等物理和化學(xué)變化而形成的[5]。傳統(tǒng)沱茶以大葉種為原料、曬青為主要原料，搭配炒青、小量烘青，中小葉種調(diào)節(jié)滋味，同樣需要一個后發(fā)酵過程[3]。因此，緊壓茶生產(chǎn)及加工過程中所產(chǎn)生的有益微生物對其風(fēng)味品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。

不同產(chǎn)地的緊壓茶微生物群落組成有所不同[6-7]。云南普洱茶的菌株種類主要以霉菌和酵母菌為主[9]；湖南茯磚茶的主要微生物有冠突散囊菌屬(Crytospora)、黑曲霉、青霉屬等[9]；四川康磚茶的細菌優(yōu)勢菌為葡萄球菌屬(Staphyloccus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，霉菌優(yōu)勢菌為黑曲霉屬、青霉屬、灰綠霉屬等[6]。六堡茶發(fā)酵時綠麹菌、灰霉菌、毛菌、白羽菌等真菌會促進茶多酚氧化水解，但是若干霉菌如黑霉菌則會使發(fā)酵茶產(chǎn)生惡劣氣味[10]；重慶沱茶的微生物群落組成目前尚不清楚。有益微生物的生長會促進緊壓茶品質(zhì)，但是雜菌的出現(xiàn)則會破壞緊壓茶的風(fēng)味質(zhì)量，影響其保健功能。因此，提高緊壓茶品質(zhì)及安全性則顯得至關(guān)重要。通過對緊壓茶進行微生物多樣性分析，可以為優(yōu)化緊壓茶微生物群落結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定其品質(zhì)提供幫助[9]。目前，關(guān)于利用高通量測序技術(shù)對廣西六堡茶和重慶沱茶中微生物菌群分布情況的分析還未見報道。

本試驗通過高通量測序，利用ITS和16S rDNA序列測定方法分析了兩種不同緊壓茶中真菌及細菌群落組成。初步探討了廣西六堡茶和重慶沱茶微生物組成差異，為尋找和利用緊壓茶中的優(yōu)勢菌，提高緊壓茶的品質(zhì)和安全性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取緊壓茶廣西六堡茶和重慶沱茶為試驗材料，兩者均為2017年生產(chǎn)的成品茶。分別編號為WY1(廣西六堡茶)和WY2(重慶沱茶)。對每個樣品取樣進行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 緊壓茶樣品微生物總DNA的提取

參照Omega微生物總DNA提取試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)的使用說明對緊壓茶樣品進行微生物總DNA的提取。

1.3 PCR擴增

真菌ITS檢測選用的擴增引物為ITS1F-ITS2R(ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS2R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[11]。細菌16S檢測選用的擴增引物為515F-907R(515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′，907R：5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)[12]。對提取的緊壓茶微生物總DNA進行PCR擴增，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后的PCR產(chǎn)物。

1.4 測序

緊壓茶樣品微生物總DNA ITS和16S rDNA測序由南京集思惠遠生物科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

對高通量測序檢測到的數(shù)據(jù)與已有的ITS區(qū)和16S區(qū)數(shù)據(jù)庫進行比對分析。對檢測到的數(shù)據(jù)進行過濾拼接，獲得有效序列[13]。利用R語言中的函數(shù)來制作OTU維恩圖和微生物群落組成的柱狀分析圖。利用Muthur軟件計算Chao-1指數(shù)和聚類分析圖，相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計利用Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

按照Omega微生物總DNA提取試劑盒的使用說明對緊壓茶樣品微生物進行總DNA提取，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測每個樣品純化后的PCR產(chǎn)物。真菌檢測的ITS序列長度為600bp，細菌16S rDNA測定的序列片段長度為460 bp，圖1表明，獲得與預(yù)期大小相符的條帶。

2.2 OTU(Operational Taxonomic Units)韋恩圖分析比較

維恩圖展示了廣西六堡茶和重慶沱茶共有的OTU數(shù)及各自特有的OTU數(shù)(圖2)。廣西六堡茶特有的真菌OTU數(shù)為18，重慶沱茶特有的真菌OTU數(shù)為87。兩樣品的真菌OTU總數(shù)為138，重合的OTU數(shù)為33，占總數(shù)的24%，且重慶沱茶有較多特有的真菌類群。細菌類群中，廣西六堡茶特有的OTU數(shù)為265，重慶沱茶特有的OTU數(shù)為20。兩者的OTU總數(shù)為403，相同的OTU數(shù)為118，重復(fù)率為29%，且廣西六堡茶的特有細菌類群遠大于重慶沱茶。

2.3 真菌和細菌多樣性分析

廣西六堡茶和重慶沱茶微生物多樣性統(tǒng)計結(jié)果見表1。廣西六堡茶的真菌群落為2門、8綱、11目、12科、14屬，細菌群落為11門、20綱、38目、71科、99屬。重慶沱茶的真菌群落為2門、5綱、5目、3科、4屬，細菌群落為8門、16綱、23目、43科、48屬。Chao-1指數(shù)是反映物種豐富度的綜合指標(biāo)，Chao-1指數(shù)越大，物種豐富度越高；Shannon 指數(shù)與群落多樣性成正比，Shannon指數(shù)越大，群落多樣性越高。由表1可知，重慶沱茶真菌的物種豐富度大于廣西六堡茶，群落多樣性則小于廣西六堡茶，而其細菌的物種豐富度及群落多樣性都小于廣西六堡茶。

圖1 廣西六堡茶和重慶沱茶的真菌及細菌PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products from fungi and bacteria in Guangxi Liubao and Chongqing Bowl teas注：A:真菌；B:細菌。M:Marker；WY1:廣西六堡茶；WY2:重慶沱茶。下同。

圖2 廣西六堡茶和重慶沱茶的真菌及細菌OTU維恩圖Fig.2 Fungal and bacterial OTU Venn diagrams of Guangxi Liubao and Chongqing Bowl teas

表1 廣西六堡茶和重慶沱茶的微生物多樣性統(tǒng)計結(jié)果

2.4 真菌和細菌物種變化分析

豐度分布曲線反映了兩種緊壓茶隨著OTU數(shù)量的增加，真菌及細菌物種豐富程度和均勻程度的變化(圖3)。當(dāng)OTU數(shù)量較少時，廣西六堡茶和重慶沱茶的真菌及細菌豐度曲線斜率較大，物種豐富程度和均勻程度較差。隨著OTU數(shù)量的增加，曲線逐漸平緩。重慶沱茶的真菌豐度曲線寬度大于廣西六堡茶，且其真菌豐度曲線比廣西六堡茶的平坦。因此，重慶沱茶的真菌物種豐富程度和均勻程度均高于廣西六堡茶。廣西六堡茶的細菌豐度曲線寬度大于重慶沱茶且其細菌豐度曲線比重慶沱茶的平坦，說明廣西六堡茶的細菌物種豐富程度和均勻程度均高于重慶沱茶。

圖3 廣西六堡茶和重慶沱茶中真菌及細菌豐度分布曲線Fig.3 Distribution of fungal and bacterial abundance in Guangxi Liubao and Chongqing Bowl teas

2.5 不同分類水平下微生物菌落分析

2.5.1 門分類水平下兩個樣品真菌及細菌的菌落結(jié)構(gòu)分析 門分類水平下，廣西六堡茶和重慶沱茶的真菌及細菌菌落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖4。廣西六堡茶的真菌菌落主要是子囊菌門(Ascomycota)，占比90.1%。重慶沱茶的真菌菌落主要是擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)，子囊菌門(Ascomycota)占比最大，為80.78%。廣西六堡茶的細菌菌落主要是放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、藍藻菌門(Cyanobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)占比最大，為49.96%。重慶沱茶的細菌菌落主要是變形菌門(Proteobacteria)、藍藻菌門(Cyanobacteria)，藍藻菌門(Cyanobacteria)占比最大，為91.45%。

圖4 廣西六堡茶和重慶沱茶門分類水平下的真菌及細菌Fig.4 Fungal and bacterial phyla found in Guangxi Liubao and Chongqing Bowl teas

2.5.2 廣西六堡茶和重慶沱茶中真菌及細菌的菌落屬結(jié)構(gòu)分析 屬分類水平下，廣西六堡茶和重慶沱茶的真菌及細菌菌落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖5。廣西六堡茶的真菌菌落主要是Blastobotrys，占比3.57%。重慶沱茶的真菌菌落主要是青霉屬(Penicillium)和煙管菌屬(Bjerkandera)，煙管菌屬(Bjerkandera)占比最大，為16.85%。廣西六堡茶的細菌菌落主要是乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、Saccharopolyspora和鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)，其中Saccharopolyspora占比最大，為47.45%。重慶沱茶的細菌菌落占比較低。

圖5 廣西六堡茶和重慶沱茶屬分類水平下的真菌及細菌Fig.5 Fungal and bacterial genera found in Guangxi Liubao and Chongqing Bowl teas

2.5.3 真菌物種豐度聚類分析 屬分類水平下對廣西六堡茶和重慶沱茶的真菌物種豐度進行聚類分析結(jié)果見圖6。廣西六堡茶和重慶沱茶相對豐度較高的真菌相差較大。廣西六堡茶的真菌優(yōu)勢菌為Blastobotrys，重慶沱茶的真菌優(yōu)勢菌為纖孔菌屬(Bjerkandera)、青霉屬(Penicillium)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)。重慶沱茶的真菌優(yōu)勢菌豐度高于廣西六堡茶。

3 討論與結(jié)論

近年來，高通量測序技術(shù)在茶樹基因組[14]、轉(zhuǎn)錄組[15-16]、小RNA組[17-18]、微生物[19-20]等領(lǐng)域取得較大的進展。本試驗利用高通量測序技術(shù)分析比較了廣西六堡茶和重慶沱茶微生物菌群組成和多樣性，發(fā)現(xiàn)Blastobotrys是六堡茶的真菌優(yōu)勢菌，鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、Saccharopolyspora、乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)是六堡茶的細菌優(yōu)勢菌。這與溫志杰等檢測到六堡茶在渥堆過程中不僅有真菌，也存在著大量細菌的結(jié)果相接近[21]。徐書澤利用高通量技術(shù)對成品六堡茶進行真菌多樣性研究時，也發(fā)現(xiàn)了Blastobotrys的存在[22]。纖孔菌屬(Bjerkandera)、青霉屬(Penicillium)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)為重慶沱茶的真菌優(yōu)勢菌，但是并沒有檢測到其明顯的細菌優(yōu)勢菌群。在整個緊壓茶茶類中，對沱茶的微生物研究極少，目前對重慶沱茶微生物菌群的研究還未見報道。重慶沱茶與下關(guān)沱茶的加工工藝相似，Li等通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)與新一代測序(NGS)對下關(guān)沱茶微生物豐度和多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中，微生物主要是真菌，且霉菌占主要優(yōu)勢，這與我們在重慶沱茶中發(fā)現(xiàn)的微生物組成種類大致相近[23]。

圖6 在屬分類水平上廣西六堡茶和重慶沱茶真菌聚類圖Fig.6 Cluster analysis on fungal genera found in Guangxi Liubao and Chongqing Bowl teas

結(jié)合本試驗中的OTU維恩圖，多樣性統(tǒng)計結(jié)果，豐度分布曲線和聚類圖等分析結(jié)果表明：重慶沱茶的真菌物種豐富度和均勻度均高于廣西六堡茶，而細菌物種豐富度及均勻度則低于廣西六堡茶，微生物群落多樣性低于六堡茶，且無細菌優(yōu)勢菌群。這種差異可能與六堡茶及重慶沱茶的加工工藝有關(guān)，兩種茶皆有毛茶初制、精制、拼配、蒸壓、干燥和陳化等基本工序，不同的是，六堡茶多了“渥堆”的關(guān)鍵工藝。渥堆時，由于溫度、濕度、養(yǎng)分適宜的原因，微生物大量繁殖，理想的生長環(huán)境為微生物多樣性創(chuàng)造了良好條件，除真菌外，還有大量細菌的存在[21]。除此之外，由于兩者的產(chǎn)地不同，氣候條件不同，在茶葉干燥時，六堡茶使用的是晾置干燥，而重慶沱茶由于產(chǎn)地空氣濕度較大，則會選擇低溫慢烘，不同的環(huán)境條件和干燥工藝可能會增加重慶沱茶真菌的物種豐富度[3,24]。六堡茶在陳化階段，隨著陳化進行，真菌多樣性會呈現(xiàn)一個先降低后升高的趨勢。本試驗中，六堡茶真菌物種豐富度和均勻度低于重慶沱茶，也可能是由于取樣時兩者處于不同的陳化階段所造成的差異[25]。

本研究通過提取廣西六堡茶和重慶沱茶成品茶的微生物總DNA，采用高通量測序技術(shù)分析比較了兩種緊壓茶的微生物組成及多樣性，初步探討了廣西六堡茶和重慶沱茶微生物組成差異，為尋找和利用緊壓茶中的優(yōu)勢菌，提高緊壓茶的品質(zhì)和安全性提供了一定的理論依據(jù)。高通量測序技術(shù)可以簡化研究步驟，縮短研究周期，快速得到實驗數(shù)據(jù)[26-27]，但是由于測序的分子片段較短，無法在種水平上進行微生物群落結(jié)構(gòu)分析，若要進一步分析緊壓茶中各種微生物對其品質(zhì)形成的作用，仍需結(jié)合傳統(tǒng)分離技術(shù)加以研究[25]。